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【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。通过Ni-Charged MagBeads纯化重组蛋白后免疫2月龄白色獭兔,采用间接ELISA(iELISA)法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。【结果】PCR扩增得到1 860bp的EGFR胞外区基因序列,成功构建pET-32a(+)-ECD载体。加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG,于37℃诱导表达6h成功得到重组蛋白,该蛋白分子质量约94ku,且为以包涵体形式存在的变性蛋白。iELISA检测抗体效价为1∶16 000;Western blot检测表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的ECD蛋白及在山羊乳腺上皮细胞和HEK293细胞中的EGFR蛋白。【结论】成功制备山羊EGFR多克隆抗体,该抗体可以用于科研试验。 相似文献
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试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。 相似文献
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【目的】制备针对南方根结线虫食道腺蛋白MiPDCD6多克隆抗体，为进一步研究南方根结线虫MiPDCD6蛋白的致病机制提供技术支持和材料准备。【方法】将扩增MiPDCD6基因的功能片段，与原核表达质粒pET-32a(+)构建重组质粒pET-32a-MiPDCD6，然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞进行诱导表达；将纯化的根结线虫Mi PDCD6融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，获得高效价高纯度的多克隆抗体。【结果】构建的重组质粒pET-32a-MiPDCD6转化大肠杆菌BL21细胞后，在诱导剂IPTG浓度1.0 mmol·L-1、摇床温度37℃、转速150r·min-1和振荡培养5 h条件下，成功表达MiPDCD6融合蛋白。ELISA和SDS-PAGE检测表明：将纯化的根结线虫Mi PDCD6融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔，获得高效价高纯度的多克隆抗体，效价约为1∶50 000。【结论】明确了MiPDCD6基因原核表达条件；制备获得的根结线虫MiPDCD6蛋白的多克隆抗体效价和纯度较高，可用于后续研究MiPDCD6蛋白在南方根结线虫致病机理中发挥的... 相似文献
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【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。 相似文献
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以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。 相似文献
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[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。 相似文献
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为了原核表达兔源抗凋亡蛋白Bcl-2,并诱导表达纯化该蛋白后制备多抗,采用RT-PCR扩增Bcl-2编码序列,并将该序列克隆至pET-32a(+)载体,获得重组pET-32a-Bcl-2质粒转化BL21(DE3),筛选最佳表达条件,通过亲和层析纯化目的蛋白质,最后经Western blot鉴定后免疫小鼠。结果显示,成功扩增Bcl-2编码序列并构建了pET-32a-Bcl-2表达载体;SDS-PAGE结果显示,在16℃,5 h,0.5 mmol/L IPTG的表达条件下,重组蛋白Bcl-2能够高效可溶性表达;Western blot结果表明纯化后的表达产物为高纯度的Bcl-2重组蛋白,将该蛋白质免疫小鼠后获得了特异性抗体,该抗体能够特异性识别重组Bcl-2蛋白,并应用该抗体鉴定RK13-B细胞中Bcl-2蛋白的过表达。 相似文献
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[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建和制备具有较强抗原性的犬埃立克体(Ehrlichia canis)重组蛋白并研究其免疫学特性。【方法】利用ABCpred等在线软件预测分析犬埃立克体gp19、gp140和gp200等蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合抗原基因E.canis-megp19及E.canis-megp-1,经PCR扩增后将其克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-E.canis-megp19和pET-32a(+)-E.canis-megp-1,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后转化至感受态细胞大肠杆菌BL21 (DE3)中,优化表达条件(IPTG诱导浓度、温度及时间),表达重组蛋白后检测其免疫原性。【结果】成功构建并合成了多表位融合抗原基因E.canis-megp19和E.canis-megp-1,其PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后分别出现大小为414和429bp的片段;重组载体pET-32a(+)-E.canis-megp19和pET-32a(+)-E.canis-megp-1双酶切后得到了预期长度的目标片段;SDS-PAGE结果显示,当加入1.0mmol/L IPTG、37℃诱导8h后,E.canis-megp19及E.canis-megp-1重组蛋白均可大量表达,其分子质量分别为38和39ku;Western blot分析显示,该重组蛋白可被犬埃立克体阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验表明,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体。【结论】制备的多表位融合重组蛋白能够高效地在大肠杆菌中表达且能够诱导机体产生特异性抗体。 相似文献
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水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
俞乐 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2010,36(4):381-384
应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为36000)),在水稻叶片样品中能检测到1条相对分子质量为36000的蛋白条带. 相似文献
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单核增生性李斯特杆菌(L.monocytogenes)的主要毒力基因hly与融合表达载体pGEX-6P-1相连,转化大肠杆菌BL-21。在摇床条件下,利用异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,分析比较不同IPTG浓度对表达产物的影响,以确定最佳的IPTG浓度。结果表明,在装有LB培养基的三角瓶中,在37℃情况下,当IPTG终浓度为0.6mmol.L-1时,hly基因的表达量最大。当再增加IPTG的浓度时,抑制重组蛋白的表达。Western-blot分析,所表达的蛋白具有抗原特异性。实验为重组李氏溶血素的工业化生产提供依据。 相似文献
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A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】原核表达A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51并研究其对A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens的体外抗菌活性。【方法】合成噬菌体裂解酶Cp51基因,并构建了pET-32a-Cp51原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导以及镍柱纯化后,获得了可溶性的Cp51重组蛋白;用比浊法检测Cp51重组蛋白的杀菌活性。【结果】噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白能够有效降低7株A型产气荚膜梭菌的浊度,裂解酶质量浓度在5μg·m L~(-1)以上、作用30 min对A型产气荚膜梭菌的杀菌率可达到99.99%以上,而对其他种类细菌无杀菌效果。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白对A型产气荚膜梭菌有较强的体外杀菌活性和特异性,研究结果为后续裂解酶Cp51的临床应用奠定基础。 相似文献
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【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。 相似文献
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本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达. 相似文献
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【目的】克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础。【方法】以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearium）F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a（+）,将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）后利用IPTG进行诱导表达。利用纯化表达产物制备多克隆抗体。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21（DE3）中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在。利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol•L-1。采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体。经ELISA法检测抗体效价为1﹕12 000,检测灵敏度为0.05×10-6 µg•mL-1。Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性。【结论】通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测。 相似文献
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根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。 相似文献
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为了获得敏感性和特异性高的TFL1多克隆抗体,本研究构建了GST-TFL1和His-TFL1原核表达载体并转入大肠杆菌表达菌株BL21中。经IPTG诱导和蛋白纯化,成功获得了分子量约为46kD的GST-TFL1和22kD的His-TFL1融合蛋白。利用纯化的融合蛋白His-TFL1作为抗原免疫,获得了TFL1的多克隆抗体血清。抗体血清经偶联了GST-TFL1融合蛋白的纯化基质进行免疫亲和纯化获得了纯化的TFL1多克隆抗体。免疫印迹检测抗体敏感性和特异性发现,纯化后的抗体不仅能特异地识别细菌内纯化的GST-TFL1和His-TFL1融合蛋白,也能与拟南芥中TFL1蛋白发生特异性反应。该研究结果为深入研究TFL1抑制植物开花的分子机制提供了有力的工具。 相似文献
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【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。 相似文献
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[目的]通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a（＋）构建原核表达重组质粒,转化原核宿主菌（Rosetta）,进行IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经纯化和复性浓缩后,免疫小鼠制备STAT-1α多克隆抗体.[结果]STAT-1α基因能与原核表达载体pET-32a（＋）构建原核表达重组质粒pET-STAT-1o,转化大肠杆菌Rosetta后的最佳体外诱导条件是IPTG 0.5 mmol/L、诱导时间6h,其重组蛋白主要以包涵体的形式表达.STAT-1α多克隆抗体具有高效特异性,与真核细胞PK-15细胞作用后,在PK-15细胞内能检测到STAT-1α蛋白表达,可观察到大部分细胞胞浆内有绿色荧光,但胞核内几乎无荧光,即STAT-1α主要定位在正常PK-15细胞的细胞浆内表达.[结论]制备获得的猪STAT-1 α多克隆抗体特异性好,既能与原核细胞大肠杆菌（Rosetta）表达的STAT-1α反应,又能与真核细胞PK-15的STAT-1α发生反应. 相似文献
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IPTG诱导浓度对重组人肝再生增强因子基因表达的影响 总被引：5，自引：0，他引：5
以人肝再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,hALR)基因与含有T7启动子的融合表达载体pET28a(+)相连的重组子(pET-A)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG作为诱导剂,分析比较不同IPTG诱导浓度对于表达产物的影响,以确定最佳的IPTG诱导浓度。结果表明,当IPTG终浓度为1.0mmol·L-1时,hALR表达量最大。这为IPTG作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了可靠的实验依据。 相似文献