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罗非鱼无乳链球菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
通过杂交瘤技术制备抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白单克隆抗体2株:1C9和6G5,均为IgM,效价分别为10-5和10-4,间接ELISA结果显示单克隆抗体1C9对无乳链球菌具有良好的检测特异性和灵敏性;同时制备兔抗罗非鱼无乳链球菌SIP融合蛋白多克隆抗体及其HRP酶标记物,兔抗SIP蛋白多克隆抗体的效价为10-6,经标记的抗体效价为10-4,最佳抗体工作浓度为1:400.建立双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测罗非鱼无乳链球菌的方法,具良好的特异性,检测灵敏度为0.85×106 CFU· mL-1.双抗体夹心ELISA检测实际应用结果与双重PCR检测比较,相对符合率为98.33％,检测结果可靠性高. 相似文献
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罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM的纯化及兔抗血清的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
为深入了解罗非鱼和斑点叉尾鮰免疫机理及建立相关免疫检测方法,采用rProtein A Sepharose亲和层析一步法纯化罗非鱼和斑点叉尾鮰血清免疫球蛋白（IgM）,并制备其兔抗血清.结果表明,rProtein A Sepharose亲和层析法可以较好地分离获得高纯度的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM,通过SDS-PAGE电泳检测,发现罗非鱼血清IgM重链和轻链分子量分别为88.0、21.0 kDa,斑点叉尾鮰血清IgM重链分子量为101.0 kDa.以纯化的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,间接ELISA检测其效价分别为1∶32000和1∶16000;Western blotting检测分析,发现罗非鱼和斑点叉尾鮰的兔抗血清分别在88.0和101.0 kDa附近各出现1条反应条带,说明其兔抗血清具有免疫活性. 相似文献
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采用饱和硫酸铵盐析和Sephadex G-200柱层析方法制备奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus(体质量为500～1 000 g)免疫球蛋白(IgM),以其为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,免疫3～4次后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法对杂交瘤进行筛选。结果表明:阳性克隆经3次亚克隆后,共获得6株针对罗非鱼IgM的单克隆抗体(mAb),分别命名为1C10、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3,所有单抗均为IgG类,各株杂交瘤的细胞上清ELISA效价为1∶800～1∶3 200;制备4B3和1G11的腹水单抗,ELISA效价分别为1∶102 400和1∶6 400。免疫印迹试验结果表明,mAb 4B3能在变性条件下识别罗非鱼IgM的重链,约在相对分子质量85 000左右。用ELISA检测4B3对罗非鱼IgM的敏感性,IgM灵敏度为10μg/L。利用所制备的单抗4B3建立了评价无乳链球菌Streptococcus agalactiae灭活疫苗免疫罗非鱼血清抗体水平的三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)方法,结果表明:腹腔注射和浸泡免疫无乳链球菌灭活疫苗14 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗无乳链球菌的抗体比对照组稍有增加;免疫21 d后,两种免疫方式的罗非鱼血清抗体均有明显增加;免疫35 d后增加更为显著,达到最高峰,注射组效价达1∶2 560,浸泡组达1∶640;免疫56 d后抗体开始下降,直到第98天还维持在明显高于对照组的抗体水平。本研究表明,所制备的罗非鱼IgM mAb可用于评价罗非鱼疫苗免疫效果及抗体产生规律等,具有广阔的应用前景。 相似文献
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利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB／c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株,分别命名为4C9、5D10、5F12,其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1：64～1：1024,腹水的效价为1：3200～1：10240,IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明,这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明,5D10和5F12具有病毒中和活性,中和效价分别为1：40和1：80。5D10相对亲和力大于5F12,3株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体,表明抗GP5蛋白中和性McAb制备成功。 相似文献
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为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。 相似文献
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以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原,应用杂交瘤技术,制备了鳗弧菌单克隆抗体3株,分别命名为1H9、1C12、6F8,细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b,其中1H9腹水效价为1∶6.4×105。制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体,效价为1∶3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫,抗鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,分别作为检测线T和质控线C,建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌,7种水产常见病原菌没有交叉反应,与鳗弧菌特异性反应,检测灵敏度为6.3×104cfu·mL~(-1),检测所需时间低于10min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。 相似文献
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《北京农学院学报》2020,(2)
【目的】通过双抗体夹心ELISA体系实现对牛妊娠相关糖蛋白boPAG2的免疫学检测,为后续研发牛妊娠检测试剂盒奠定基础。【方法】将自制boPAG2作为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,以细胞融合技术对呈阳性的杂交瘤细胞进行筛选。运用ELISA相加性试验筛选最佳配对抗体,初步建立起双抗体夹心酶联免疫吸附试验系统,采集牛场中120头荷斯坦奶牛血清样本进行初筛。【结果】筛选出3株能稳定分泌boPAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2C01,5E02,3B05。纯化出单克隆抗体滴度为(1∶22.48×10~4)～(1∶11.96×10~4),免疫球蛋白亚型均为IgG。ELISA相加性试验筛选出2株可识别boPAG2抗原不同表位的最佳配对抗体5E02和3B05。当5E02作为包被抗体,3B05作为检测抗体时,其最佳稀释质量浓度为1.25μg/mL,检测boPAG2的灵敏度可达5μg/mL。【结论】制备和选定了两株最佳配对单克隆抗体5E02和3B05,该对抗体效价高,通过建立双抗体夹心ELISA体系实现对boPAG2的免疫学检测,并对少量血清样品进行了初步鉴定。 相似文献
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制备抗沙眼衣原体(CT)单克隆抗体,建立沙眼衣原体的胶体金免疫层析快速检测方法。采用纯化沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)免疫Balb/c小鼠,选取高效价的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA检测筛选分泌抗MOMP单克隆抗体(McAb)的细胞株并进行相关鉴定。共获得分泌IgG1,IgG2b和IgM的3株单克隆抗体杂交瘤细胞株。纯化的单克隆抗体与鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体均无交叉反应。通过位点分析选择配对良好的两株McAb,制备检测CT的双抗体夹心法免疫层析试纸条。制备的胶体金试纸条对MOMP的最低检出值可达50 ng·mL-1。 相似文献
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谷胱甘肽转移酶标签蛋白单克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
以纯化的谷胱甘肽转移酶标签蛋白(GST)免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用纯化的GST筛选,最终获得一株抗GST的杂交瘤细胞系(命名为1D10),染色体平均记数为90对,间接ELISA检测1D10细胞培养上清的效价为1:4 000。腹水效价为1:5×107,该单抗可以特异识别GST蛋白和带有GST标签(GST-tagged)的融合蛋白。 相似文献
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高亲和力的农药克百威单克隆抗体的制备及鉴定 总被引：2，自引：1，他引：2
【目的】制备高亲和力农药克百威单克隆抗体，建立克百威残留免疫检测方法，控制克百威残留，保障人民身体健康与保护环境。【方法】合成克百威半抗原BFNB，用人工抗原BFNB－BSA免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合，经间接ELISA筛选及显微克隆法亚克隆，分离出阳性细胞株，腹水诱导法及辛酸－硫酸铵沉淀法大量制备及纯化单克隆抗体，间接ELISA法测定抗体滴度及亲和力，间接竞争ELISA法测定抗体特异性。【结果】获得1株稳定分泌抗克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3，其培养上清和腹水抗体滴度分别为1﹕2.048×103和1﹕1.024×106，其抗体亚类为IgG1，亲和力常数为2.54×109 L•mol-1，IC50为1.18 ng•ml-1，最低检测限为0.01 ng•ml-1。与克百威降解产物呋喃酚的交叉反应率为4.59×10-4％，另外几种结构类似的氨基甲酸酯类农药的交叉反应率均小于3.0×10-4％。【结论】此抗克百威的单克隆抗体亲合力高、特异性强，为建立克百威简便、快速、特异的免疫检测方法奠定了基础。 相似文献
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用纯化的重组PRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗PRV VP6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名C5D10。经鉴定C5D10为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数为93,细胞培养液上清及腹水效价分别为18∶00和11∶×106,且C5D10单克隆抗体不与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应,显示良好的特异性。 相似文献
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为快速、准确检测环境中的菲(Phe),研究制备了抗菲单克隆抗体,并分析了抗菲单克隆抗体的免疫学特性。采用活泼酯法将2-菲丁酸与载体蛋白(BSA、OVA)共价连接制备免疫抗原(Phe-BSA)和检测抗原(Phe-OVA)。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描图谱分析及计算偶联比验证偶联结果。采用足垫法免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术、阳性杂交瘤筛选及克隆制备出抗菲单克隆抗体。结果表明:完全抗原制备成功,获得1株能稳定分泌抗Phe抗体的杂交瘤细胞株1G7,纯化后抗体效价为1∶6.4×105,亲和力常数为3.29×108L/mol。该单克隆抗体亚型为Ig G1,对Phe的IC50值为17.82 ng/m L,与5种多环芳烃具有交叉反应,可用于对环境中多种PAHs的广谱检测。 相似文献
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为制备哺乳动物促卵泡素(FSH)单克隆抗体,比对了人类、家畜、部分野生动物、鼠类等哺乳动物FSH氨基酸序列,分析其种间同源性,结果发现,多种哺乳动物FSHβ亚基氨基酸序列的同源性高于80%,且线性抗原表位高度保守。从奶牛垂体组织扩增FSHβ亚基CDS片段,构建p ET28aFSH重组质粒,诱导表达FSH重组蛋白,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞孔,取效价最高孔进行克隆和亚克隆,获得1株能够分泌抗FSH的单克隆抗体细胞株,命名为B4A5。B4A5细胞株经过数次传代培养、反复冻融后生长状态良好,且能够稳定分泌抗体。采用细胞株体外培养和小鼠腹水诱生法均制备了抗FSH的单克隆抗体,其效价分别为1∶640、1∶106。分别采用Western blot和间接ELISA法鉴定单克隆抗体的结合特异性和交叉反应性,结果显示,制备的单克隆抗体与FSH反应呈阳性,与促黄体素(LH)、促甲状腺素(TSH)、促乳素(PRL)、人绒毛膜促性腺激素(h CG)均无交叉反应性。综上,获得了1株能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体可特异性结合FSH蛋白。 相似文献
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[目的]比较以原核表达蛋白与纯化病毒制备单克隆抗体的特性。[方法]RT-PCR扩增IBDVVP2基因,通过原核表达系统表达目的蛋白,并亲和纯化重组蛋白。尿囊液扩增IBDV,并通过超速离心纯化病毒。分别用纯化的重组VP2蛋白和IBDV免疫Balb/c小鼠,ELISA筛选杂交瘤细胞株。[结果]获得了2株分泌VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价均为1∶2×104;4株分泌IBDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价分别为1∶2×106,1∶6×104,1∶1×105,1∶4×103。所有单克隆抗体均与其制备用免疫原反应,不与空载体或其他病毒抗原反应。经10～20次传代,仍保持稳定的效价。[结论]纯化的原核表达VP2蛋白和IBDV均能诱导小鼠产生免疫应答;用原核表达的VP2蛋白作为免疫原,可以获得特异的VP2抗体。 相似文献
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纯化浓缩水泡性口炎病毒(VSV-IN)作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,当免疫抗体效价达到融合要求时,在融合前3d尾静脉加强注射免疫原,取免疫的Balb/c小鼠的脾脏与SP2/0细胞在PEG4000作用下,融合、筛选、克隆获得5株稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Balb/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株,收集腹水初步纯化,获5株单克隆抗体,亚类鉴定分属IgG2a和IgM型。 相似文献
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[目的]制备鸡MHCⅡ类分子的单克隆抗体。[方法]在分析鸡MHCII类分子蛋白序列基础上,选取鸡MHCⅡα链基因第2～6外显子和β链基因第3～6外显子进行原核表达,以纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆和间接ELISA筛选阳性细胞株。[结果]共得到1株分泌鸡MHCⅡα链抗体和2株MHCⅡβ链抗体的杂交瘤细胞,分别命名为MHCⅡα-4、Ⅱβ6-2和Ⅱβ6-31,其腹水效价分别为1∶256000、1∶256000和1∶1280000。Western blotting分析表明其特异性强,能与相应蛋白结合。[结论]成功获得了3株稳定分泌抗鸡MHCⅡ类分子抗体的杂交瘤细胞。 相似文献