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1.
试验旨在克隆文山牛SIRT2基因，检测SIRT2基因在文山牛不同组织中的表达谱并进行序列分析，鉴定其在293A细胞系中的亚细胞定位。参照GenBank中牛SIRT2基因序列（登录号：NM_001113531.1），在其保守区设计1对特异性引物，以cDNA为模板克隆文山牛SIRT2基因，进行同源性和系统进化分析；以GAPDH基因为内参分析SIRT2基因在文山牛心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、结肠、肌肉、脂肪8个组织中的表达水平；构建pDsRed-SIRT2真核表达载体并转染到293A细胞系中表达，观察融合蛋白的亚细胞定位。结果表明，文山牛SIRT2基因开放阅读框全长1 173 bp，编码390个氨基酸，分子质量为43.3 ku，理论等电点为4.985；SIRT2编码蛋白整体表现为亲水性，带有负电荷。文山牛与水牛、白豚、蹄蝠等哺乳动物具有较高的同源性，在系统发育树中距离最近，但与树袋熊距离稍远，推测有袋目哺乳动物在进化过程中过早地与其他哺乳动物产生了遗传差异，在哺乳动物遗传相关的研究中需特殊考虑有袋目哺乳动物。实时荧光定量PCR结果显示，SIRT2基因在文山牛8个组织中均有表达，在肌肉和肝脏中的表达水平较高，与其他组织存在显著差异（P<0.05）。pDsRed-SIRT2融合蛋白主要定位于293A细胞的细胞质中，可能参与部分细胞器的运作及细胞内物质的运输，调节细胞稳态并在细胞繁殖过程中提供必要的能量物质。本试验结果为进一步探究牛SIRT2基因功能提供了一定的理论依据。 相似文献
2.
本研究旨在克隆水牛SIRT6基因,构建真核表达载体,并对该基因进行生物信息学及组织表达谱分析。以牛SIRT6基因编码区为种子序列(GenBank登录号:NM_001098084.1),应用Oligo 7.0软件设计引物序列,用RT-PCR方法扩增水牛SIRT6基因完整编码区序列,测序鉴定后进行生物信息学分析,构建逆转录病毒载体pMXs-SIRT6-IRES-GFP,并在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞上进行重组载体表达鉴定;采集水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴分别提取RNA,反转录后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR,检测SIRT6基因在各组织中的表达差异。结果表明,水牛SIRT6基因编码区全长1 080 bp,编码359个氨基酸,其中亮氨酸及脯氨酸含量最高(10.3%),酪氨酸含量最低(1.1%)。水牛SIRT6基因核苷酸序列与牛、人和小鼠的同源性分别为98.4%、86.7%和78.5%,物种间同源性较低。系统进化树结果表明,水牛与牛聚为一支,再与人、小鼠聚为一大支,亲缘关系相对较近,与果蝇亲缘关系较远。SIRT6蛋白理论分子质量为39.47 ku,分子式为C_(1737)H_(2783)N_(509)O_(516)S_(13),等电点为8.48,不存在跨膜区,为膜内蛋白;含有Sirtuin家族特有的Sir2去乙酰化酶的催化结构。二级结构预测结果显示,水牛SIRT6蛋白包含13个α-螺旋、27个β-折叠、24个T-转角和20个无规则卷曲。逆转录病毒载体介导的SIRT6基因能在HEK-293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞中表达。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT6基因在水牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、脑、皮肤、生殖嵴中均有表达,其中在生殖嵴中表达量最高,在皮肤中的表达量次之,而在肝脏中表达量最低。本试验结果将为水牛SIRT6基因的功能研究提供参考。 相似文献
3.
试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。 相似文献
4.
旨在分离猪PYGO2编码区序列，获悉该基因mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征、细胞中的分布和定位，并构建蛋白相互作用网络。本研究首先利用RT-PCR从成年版纳微型猪近交系（BMI）睾丸组织中克隆PYGO2编码区序列；利用生物信息学解析其基因结构并对蛋白质进行多种功能分析，比较多个哺乳动物PYGO2的氨基酸序列同源性，构建系统进化树和蛋白质相互作用网络；然后利用qPCR技术检测PYGO2在15个组织中的mRNA表达情况；最后通过构建pEGFP-C1-PYGO2融合表达载体，转染猪睾丸细胞（ST），确定PYGO2的亚细胞定位。结果表明，PYGO2基因CDS长1 221 bp，编码406个氨基酸（基因和氨基酸号分别为KY644518和AVB77243.1），定位在猪4号染色体；PYGO2蛋白二级结构以无规则卷曲为主，N端和C端均疏水；氨基酸序列同源比对分析表明，猪PYGO2与其他哺乳动物的相似度均大于97%，在进化上高度保守；蛋白互作网络分析显示，猪PYGO2与9个蛋白可能存在相互作用，其中与BCL9蛋白作用最为紧密；qPCR表达分析表明，猪PYGO2在被检的15个组织中均有不同程度表达，在生殖腺中表达相对较高；ST细胞中的亚细胞定位结果表明，PYGO2 mRNA主要分布在细胞核。本研究获得了PYGO2基因的编码序列，蛋白质结构和定位，蛋白质相互作用网络，mRNA多组织表达特征，可为进一步解析该基因在猪精子生成中的分子机制提供参考。 相似文献
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旨在克隆Marc-145细胞蛋白激酶R(PKR)基因,对其进行遗传特性及表达研究。利用RT-PCR克隆获得Marc-145细胞PKR基因,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性与遗传进化分析;将该基因分别插入pEGFP-C1与pEGFP-N1多克隆位点,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合真核重组质粒,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察、Western blot检测EGFP标签,开展PKR融合表达研究。结果显示,成功克隆获得Marc-145细胞PKR基因,编码区为1 653 bp,推导编码550个氨基酸,与选取的灵长类及哺乳动物参考物种PKR基因核苷酸序列同源性在72.2%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在55.4%～99.5%之间,与豚鼠及其供体物种非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)同源性分别为最低、最高;成功构建了EGFP-PKR融合质粒,但荧光蛋白观察及Western blot检测表明,仅C端融合质粒成功表达。结果表明,成功克隆了Marc-145细胞PKR基因并进行了融合表达,为进一步开展猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在感染细胞与细胞内... 相似文献
6.
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为深入研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的生物学功能,了解其在哺乳动物细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR扩增牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E_2基因,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将构建的重组质粒pc DNA3.1/V5His A-E_2经脂质体介导转染至MDBK细胞。继续培养48h后,在激光共聚焦显微镜下观察E_2蛋白在细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,E_2蛋白在细胞核与细胞质中均有表达,且绿色荧光呈点状均匀分布。该研究为进一步研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的相关功能奠定了基础。 相似文献
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鸭A-FABP基因的克隆及其组织表达 总被引：4，自引：1，他引：3
本文采用RT-PCR方法从35周龄母鸭脂肪组织中克隆了A-FABP基因的cDNA序列,其长度为422 bp,包含了1个399 bp的完整CDS,编码132个氨基酸。该序列与家禽（鹅、鸡）和哺乳动物（人、小鼠、猪、牛）的A-FABP基因序列约有94%和73.4%-75.7%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性为92.4%和72.0%-77.3%。半定量RT-PCR研究结果为A-FABP基因在间脑、肺和肾组织中不表达,在脂肪组织中的表达明显高于其他组织（P〈0.5）。表明A-FABP基因在动物进化中具有高度保守性,该基因的表达具有组织特异性。 相似文献
9.
应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2019,(12):2386-2391
旨在克隆并分析水牛赖氨酸特异性去甲基化酶4A (lysine-specific demethylase 4A,KDM4A)基因,并检测其在水牛不同组织中的表达情况,探讨KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能。提取卵巢组织的RNA,获得水牛KDM4A基因CDS区的全长序列。结果显示,水牛KDM4A基因编码区全长3 151 bp,编码1 067个氨基酸。水牛KDM4A基因与黄牛、绵羊、骆驼和家犬的同源性分别为99%,97%,92%,91%;且在不同物种间高度保守,符合生物的进化规律。KDM4A蛋白包含369个α-螺旋,85个β-转角,409个无规卷曲和204个延伸链,为亲水不稳定的酸性蛋白。qRT-PCR结果显示,KDM4A在水牛肌肉、肺脏、卵巢、大脑、皮肤、心脏、脾脏、肾脏和肝脏组织中均有表达,其中肌肉、肺脏、卵巢中表达量较高,肝脏和肾脏中表达量较低。本研究克隆得到了沼泽型水牛KDM4A基因,并对不同组织内KDM4A进行了基础的生物信息学分析,为阐明KDM4A在水牛胚胎发育过程中的功能,提高水牛胚胎发育水平提供理论基础。 相似文献
11.
《中国预防兽医学报》2016,(5)
为了解乌苏里貉TLR8基因特点及其在不同组织中的表达水平,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆其c DNA全长序列,应用生物学软件分析该基因及预测其编码蛋白的特征,并对该基因在乌苏里貉不同组织中的表达水平进行检测。结果显示该基因全长3 191 bp,ORF全长3 117 bp,编码1 038 aa,含有Toll-like受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示乌苏里貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高,达99.3%,与其他食肉目哺乳动物也具有较高的同源性,在89.2%~92.9%。组织表达分析显示TLR8基因在乌苏里貉各组织中广泛表达但表达量存在差异。本研究结果为进一步研究乌苏里貉抗病毒免疫及育种相关研究奠定了基础。 相似文献
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试验旨在对沼泽型水牛ALK3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在水牛组织中的表达规律进行系统研究.根据GenBank中已公布的牛ALK3基因序列设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增、克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法分析和预测了水牛ALK3的遗传进化及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用QRT-PCR技术对ALK3基因在水牛组织中的表达进行了差异分析.结果表明,水牛ALK3基因编码区全长1 599 bp,共编码532个氨基酸.多重序列比较分析显示,水牛ALK3核苷酸序列与牛、绵羊、猪、马、人和小鼠相应序列的同源性分别为98%、96%、95%、93%、94%和91%.系统进化树分析显示,ALK3基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性.对ALK3蛋白质的分析表明该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在丝氨酸/苏氨酸激酶和GS等结构.定量分析结果显示,ALK3在水牛生殖脊、心脏、肝脏、颗粒细胞、肺脏、卵丘细胞、肾脏、下丘脑、垂体、大脑等15种组织或细胞中有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,垂体、肺脏和睾丸次之,卵丘细胞表达量最低.本研究成功克隆了沼泽型水牛ALK3基因,并研究了其在不同水牛组织细胞中的表达规律,为阐明其在水牛繁殖过程中的功能及转基因载体构建中的应用研究奠定了理论基础. 相似文献
13.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(21)
为了分析ASB12基因在牛生长发育中的作用,试验以延边黄牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆ASB12基因的编码区序列及部分基因组序列,利用生物信息学方法对ASB12基因进行分析,同时采用半定量方法检测ASB12基因在不同组织的表达情况。结果表明:所克隆的牛ASB12基因编码区序列长度为1 055 bp,部分基因组序列长度为1 598 bp(Gen Bank登录号为HQ608159),包含1个内含子。生物信息学分析显示,该蛋白可能存在3个N-糖基化位点,3个豆蔻酰化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点;存在1个保守的结构域,与蛋白ANK具有较高的同源性。组织表达谱分析显示,牛ASB12基因在肌肉等多种组织中均有表达。 相似文献
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本研究旨在克隆水牛MBD3基因,进行生物信息学分析,并构建MBD3基因的真核表达载体,为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞（iPSCs）中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA,反转录得到cDNA,并以此为模板,应用RT-PCR克隆得到MBD3基因,测序并应用相关的生物学软件进行分析;将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP-C1,再将携带目的基因的重组质粒转染HEK293T细胞和水牛胎儿成纤维细胞（BFF）,利用RT-PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明,克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列,其中编码区全长774 bp,编码257个氨基酸。通过对MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析,MBD3基因在进化中高度保守,特别是MBD结构域,水牛与牛的同源性为100%,与人、猪、猩猩的同源性均为97%。将水牛MBD3基因真核表达载体转染HEK293T细胞和BFF,通过荧光观察、RT-PCR及Western blotting方法鉴定表明,成功构建了水牛MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的MBD3基因,并成功构建了MBD3基因的真核表达载体,为进一步研究MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。 相似文献
15.
《中国兽医学报》2017,(11)
根据已知人、小鼠、牛、鸡、犬和恒河猴等物种的DEAD-box解旋酶1(DEAD-box helicase 1,DDX1)基因mRNA序列设计引物,从猪肾传代细胞系(PK-15)中克隆DDX1基因编码区(CDs)序列,对该基因进行生物信息学分析、组织表达谱分析。进一步将猪DDX1基因CDs序列克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B,构建的重组真核表达质粒转染PK-15细胞后运用Western blot和间接免疫荧光试验检测DDX1基因的真核表达。结果显示:成功克隆了猪DDX1基因的cDNA序列(GenBank登录号为KU522467),其开放读码框全长为2 223bp,编码740个氨基酸;与牛、鸡、黑猩猩、犬、人、小鼠、大鼠和恒河猴的氨基酸序列同源性分别为98.8%、93.5%、97.6%、98.8%、97.7%、97.0%、97.6%和97.8%。表达谱分析表明,猪DDX1mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,表现为脂肪、肝脏和脾脏中高表达,而在胃、心脏和肌肉中表达较低。成功构建了猪DDX1基因真核表达质粒,经证实目的基因可以在真核细胞中特异性表达,且表达的DDX1蛋白主要定位于细胞质中,少量定位于细胞核中。结果表明:本试验克隆了猪DDX1基因的序列,分析了其在不同组织的表达规律,并构建了DDX1基因重组表达质粒,为该基因下一步的功能学研究奠定了基础。 相似文献
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为了研究番鸭Viperin蛋白在感染番鸭呼肠孤病毒(MDRV)细胞和组织中的表达情况,以及其是否具有抗MDRV作用,采用RT-PCR方法检测番鸭Viperin基因在感染MDRV不同时间点293T细胞、番鸭鸭胚成纤维细胞(MDEF)和雏番鸭脾脏中的表达情况;并采用RT-PCR方法从番鸭脾脏中扩增出Viperin基因片段,将其克隆到真核表达载体p Flag-CMV-5a中,测序验证后转染入293T细胞,运用Western-Blot技术鉴定蛋白表达情况;最后用MDRV感染过表达番鸭Viperin的293T细胞,通过RT-PCR和qRT-PCR检测病毒在细胞中的增殖情况。结果表明,Viperin基因在感染MDRV的293T细胞、MDEF细胞和雏番鸭脾脏中表达量均升高;MDRV P10基因在过表达番鸭Viperin基因的293T细胞中的表达量显著低于对照组(P0.01),证实番鸭Viperin蛋白具有抑制MDRV增殖的作用。 相似文献
17.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(7)
为了阐明水牛ALK5基因在水牛卵泡发生过程中的作用,了解其在水牛不同组织中的表达模式,试验采用了RT-PCR及QRT-PCR方法对ALK5基因进行了研究,参考已公布的Gen Bank中牛ALK5基因序列,设计特异性引物应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析和预测了水牛ALK5基因的遗传进化、蛋白质的理化性质、二级和三级结构,并应用QRT-PCR技术对ALK5基因在水牛组织的表达进行了差异分析。结果表明:水牛ALK5基因的编码区全长为1 512 bp,共编码503个氨基酸;水牛ALK5核苷酸序列与牛、绵羊、猪、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、97%、95%、93%和90%,结合系统进化树分析结果推测ALK5基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性;该蛋白呈弱碱性,有信号肽,细胞亚定位于胞膜上,存在low complexity和GS结构,呈典型跨膜蛋白结构;水牛ALK5基因在肺脏、垂体、下丘脑组织中不表达,在水牛大脑、肝脏、骨骼、卵巢、肌肉和心脏等12个组织细胞中具有不同程度的表达,其中卵巢中表达量最高,心脏和肾脏次之,肌肉表达量最低。说明试验成功地克隆了沼泽型水牛ALK5基因,其具备典型的TGF-β受体家族结构,表达具有一定的组织特异性。 相似文献
18.
实验旨在研究布莱凯特黑牛MYPN基因CDS区序列和表达情况,探讨MYPN基因理化性质及表达规律,为探究其与肌肉生长发育关系奠定基础。克隆结果表明：MYPN基因CDS区全长2 841 bp;进化树结果显示：布莱凯特黑牛MYPN基因与牛（100%）、绵羊（97.57%）、山羊（97.50%）同源性高;生物信息学分析表明：MYPN编码946个氨基酸,为亲水性不稳定碱性蛋白;qRT-PCR结果显示：MYPN在背最长肌中表达量最高;免疫组化显示：MYPN主要在肌浆内的肌原纤维中表达;Western Blot结果显示：MYPN蛋白在肌肉中表达量最高。综上,MYPN参与肉牛肌肉生长发育的调节,可作为肉质性状辅助标记基因。 相似文献
19.
为了解腺病毒穿梭载体介导NcSAG1基因在293细胞中的表达情况,本试验应用PCR技术扩增牛源新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD-18T-NcSAG1克隆质粒和腺病毒重组穿梭质粒pCR259-NcSAG1,将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组质粒转染293细胞,应用免疫荧光试验(IFA)和Western blot技术检测pCR259-NcSAG1重组质粒在293细胞中的表达。结果显示:扩增的牛源新孢子虫NcSAG1基因长度为982 bp,与GenBank中发表的NcSAG1(AF132217)核苷酸序列同源性为99%,IFA检测构建的pCR259-NcSAG1重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,Western blot分析表达蛋白的分子量为33 ku,具有较好的反应原性。本试验为NcSAG1腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。 相似文献
20.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(15)
为了进行猪A-FABP基因的克隆及不同器官组织中的差异表达,试验采用RT-PCR方法从长白猪背最长肌中克隆A-FABP基因的cDNA序列并进行测序比对,分别与人、牛、山羊、家鼠及鸡进行同源性比较,应用半定量RT-PCR方法检测猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌中A-FABP基因的表达。结果表明:成功克隆得到A-FABP基因的cDNA序列,且比对结果为100%,该序列与人、牛、羊的同源性分别为90.98%、89.97%、89.97%,与鸡的同源性为73.68%。半定量RT-PCR结果为A-FABP基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌器官组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,肺脏内的表达量最低,A-FABP基因在动物进化中具有高度保守性,该基因在猪不同器官组织中的表达具有差异性。 相似文献