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1.
为建立检测牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3 A型150 bp、B型253 bp和C型342 bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×104、0.92×104和1.53×104拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。 相似文献
2.
为建立检测牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛支原体(M.bovis)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的BPIV3的HN基因、IBRV的g C基因、BVDV的5'UTR和M.bovis的oppD/F基因序列设计特异性引物,通过优化反应条件建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法。结果显示,该方法对牛呼吸道合胞体病毒、小反刍兽疫病毒、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀巴氏杆菌A型和B型无特异性扩增,对BPIV3和BVDV的cDNA最低检测量分别为100 pg和1 ng,对IBRV和M.bovis的DNA最低检测量分别为10 pg和100 pg,具有较高的特异性和灵敏性。对临床33份鼻拭子样品和12份牛肺样品的检测结果与已发表文献中PCR方法的检测结果一致。本研究建立的多重PCR检测方法可同时对BPIV3、IBRV、BVDV和M.bovis进行检测,为这4种病原的诊断和检测提供了一种实用、便捷的方法。 相似文献
3.
为探究新疆某集约化牛场1～6月龄犊牛群中牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染情况,对采集的60份犊牛鼻拭子样品进行RT-PCR检测、病毒分离鉴定及全基因组测序和遗传进化分析。结果显示,样品中BPIV3核酸阳性率为11.67%。从核酸阳性样品中分离获得1株BPIV3,并命名为XJ21032-1(45),其基因组全长为15 512 bp;遗传进化分析表明,XJ21032-1(45)属于BPIV3 B基因型,该分离株与澳大利亚的BPIV3 B基因型参考株Q5592(EU277658)的同源性最高为93.4%。本研究成功分离得到了1株B基因型BPIV3,证实B型毒株在我国的存在和流行,为BPIV3疫苗研发提供了原材料,也有助于我国BPIV3分子进化规律及溯源的进一步研究。 相似文献
4.
5种人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的初步建立 总被引：2，自引：1，他引：1
为建立可同时检测裂谷热病毒(RVFV)、戊型肝炎病毒(HEV)、狂犬病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)及口蹄疫病毒(FMOV)5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR快速检测方法,本研究根据GenBank登录的上述5种病毒的全基因组序列,设计了5对多重PCR引物,通过优化反应条件,建立检测以上5种病毒的多重RT-PCR方法.通过对同一种属的其他病毒及相关病毒的检测,确定方法的特异性;通过对体外转录合成的RNA进行定量检测的方法,确定方法的敏感度.实验结果表明:在同一RT-PCR反应体系中可同时检测以上5种病毒,扩增片段长度分别为499 bp、137 bp、274 bp、224 bp、389 bp;而对新城疫病毒(NDV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛流行热病毒(BEFV)和乙型脑炎病毒(JBEV)的检测均为阴性;5种病毒RNA的最低检测拷贝数分别为2.91×104、3.14×1 03、1.25×103、6.65×103和2.38×104.利用该方法对11份RV已知阳性样本和7份HEV已知阳性样本检测结果均呈阳性.本研究建立了一种快速、可同时检测5种人兽共患病病毒的多重RT-PCR检测方法,该方法具有良好的特异性和较高的敏感性. 相似文献
5.
《中国兽医学报》2016,(10)
根椐GenBank中已发表中病毒性腹泻病毒(BVDV)、中冠状病毒(BCoV)和中肠道病毒(BEV)基因的保守序列,设计合成引物,在建立单一病毒RT-PCR检测方法的基础上,继续优化条件,建立上述3种病毒的多重RT-PCR检测方法,并应用建立的检测方法对临床样本进行检测,计算符合率。结果表明,引物浓度分别为BVDV 0.5μL(20μmol/L),BCoV 0.25μL(20μmol/L),BEV 0.25μL(20μmol/L),退火温度为52℃时,可同时扩增BVDV的289bp,BCoV的458bp和BEV的732bp的特异性片段,对牛流行热病毒(BEFV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)均无扩增。该方法最低能检出6.4pg的BVDV,1.28pg的BCoV和6.4pg的BEV的等量混合质粒模板。对24份临床腹泻病料进行检测,与单项RT-PCR检测的符合率为100.0%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法,具有准确、快速、特异的特点,可用于临床混合感染的同时检测。 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2016,(2)
为建立牛副流感病毒3型(BPIV3)双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPIV3单克隆抗体(MAb)与兔抗BPIV3多克隆抗体(PAb)。以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPIV3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件。结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1:25 600和1∶12 800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合。建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10μg/m L,37℃孵育1 h;检测抗体最佳工作浓度为2.5μg/m L,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min。判定的临界值为0.451。本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强。检测下限为10~3TCID_(50)。批间和批内变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6%。本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西省的30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。 相似文献
8.
为建立同时检测基因A型和C型鸭甲肝病毒(DHAV-A,DHAV-C)的双重RT-PCR方法,本实验根据GenBank中DHAV-A和DHAV-C全基因组序列,针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物,通过对反应体系和反应条件的优化及特异性、灵敏度评价,建立了检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法.该方法能够分别从DHAV-A、DHAV-C阳性样本中扩增出DHAV-A (259 bp)和DHAV-C (194 bp)的特异片段,而不与其它被检的无关病原发生非特异反应;对DHAV-A和DHAV-C的最低检出限分别为4.98×104拷贝/μL、1.68×104拷贝/μL;对2009年8月至2011年7月送检病料检出DHAV-A和DHAV-C的阳性率分别为20％(14/70)、70％(49/70);随机抽取的DHAV-CPCR阳性样本的病毒分离结果与双重RT-PCR检测结果的符合率为100％(16/16).本研究结果显示,建立的双重RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于临床DHAV的快速鉴别诊断. 相似文献
9.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。 相似文献
10.
BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
参照GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因序列,分别针对BPIV3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物,经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法。最佳扩增条件为94℃30s,56.2℃30s,72℃1min,循环30次;72℃延伸5min,16℃10min;BVDV引物浓度为1.0μmol/L,BPIV-3引物浓度为0.5μmol/L。采用该方法检测BPIV-3和BVDV参考病毒株,能同时扩增出预期为425bp和294bp大小的特异性片段,而扩增牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、致病性大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和鼠伤寒沙门菌等均呈阴性反应。对参考病毒株进行梯度稀释检测,结果证明该方法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3 TCID50/0.1mL,而BVDV的灵敏度达102 TCID50/0.1mL。 相似文献
11.
为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP (rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105.间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgGl/κ.特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应.免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原.该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件. 相似文献
12.
旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。 相似文献
13.
为了对宁夏地区患有呼吸系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,试验主要利用RT-PCR方法对样品进行牛副流感3型病毒(BPIV3)M基因序列扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行亚克隆。通过氨苄青霉素平板筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定并利用分子生物学软件与GenBank上参考序列进行同源性比对。测序结果表明,从样品中分离到了1株BPIV3,并命名为NX49,其M基因全长为1056bp;进化分析表明,NX49隶属于BPIV3C基因型,其M基因与中国山东C型分离株SD0835具有较高同源性,核苷酸同源性为99.4%;理化分析表明,该毒株对温度、酸及有机物均敏感,高温孵育下Mg2+对该病毒无保护力;血凝试验表明,NX49对豚鼠红细胞凝集效价仅为1∶4,且仅在4℃孵育时出现凝集反应。本研究成功分离得到一株BPIV3C型毒株,这将有助于中国BPIV3分子进化规律及病毒流行特点的进一步研究。 相似文献
14.
《现代畜牧兽医》2017,(5)
本研究建立了检测牛副流感病毒3型的SYBR Green Ⅰ Q-PCR方法。根据Gen Bank发表的BPIV3序列进行对比分析,选取P基因上保守区域设计特异性引物。优化反应体系,建立Q-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。结果显示,构建的标准曲线在10~4~10~8copies.μL~(-1)内具有较好的线性关系,相关系数达到0.998,斜率为-3.370,Q-PCR扩增效率为98%。特异性试验中,利用该方法对BPIV3a及BPIV3c进行检测为阳性,对牛疱疹病毒I型、牛病毒性腹泻病毒进行检测,结果呈阴性。敏感性试验中,该方法对标准品的最小检出量为1.0×10~3 copies.μL~(-1)。重复性试验中,Ct值变异系数均小于1.0%。表明SYBR Green Ⅰ Q-PCR法能够快速地对病原进行诊断,该方法具有较强的特异性、良好的敏感性及重复性,为实验室诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。 相似文献
15.
为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。 相似文献
16.
《中国兽医学报》2016,(3)
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列设计2对特异性引物,第1对通用引物扩增美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因(466bp/376bp),第2对引物特异性扩增欧洲型毒株ORF7基因(580bp)。反应条件优化后,建立了能够同时检测美洲型经典毒株、美洲型变异毒株和欧洲型毒株的多重PCR检测方法。该方法可以特异性扩增3种毒株的基因,目的基因片段大小差异在90bp以上便于电泳观察,重组质粒标准品检测下限为1.93×103拷贝。应用该方法检测183份临床疑似病例,结果 PRRSV阳性35份,其中美洲型经典株2份,美洲型变异株31份,欧洲型毒株3份,美洲型变异株和欧洲型毒株混合感染1份。表明建立的多重PCR检测方法具有快速、准确、敏感等优点,对PRRSV 3种毒株的快速诊断有十分重要的意义。 相似文献
17.
根椐GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)3种病毒基因序列,设计引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术,用这3对引物对同一样品中的BVDV、BCV、BRV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果可同时扩增BVDV的466 bp,BCV的685 bp,BRV的247 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型扩增结果均为阴性。敏感性测定表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BRV和10 pg的BCV模板。用45份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,显示两者的总符合率为100%。表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
18.
为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下纯化后将其作为包被抗原,建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示作为包被抗原的重组N蛋白仅与BPIV3阳性牛血清发生特异性反应,与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒等牛的常见病原无血清学交叉反应,表明其特异性较强。牛BPIV3阳性血清在1:640倍稀释时按该方法检测仍为阳性,显示该方法具有较高的敏感性。重复性试验显示批内变异系数小于6%,批间变异系数小于12%,表明该方法具有较好的稳定性。对94份牛血清的比较试验显示,本研究建立的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。利用该方法检测了394份采自接种过BPIV3灭活苗牛场的血清样品和95份未接种疫苗牛场的血清样品,结果接种疫苗的牛血清均呈强阳性,而95份未接种疫苗牛血清的阳性率为80%。本研究建立的间接ELISA方法可以试用于国内BPIV3的流行病学调查和免疫监测,为国内BPIV3的防控提供技术支持。 相似文献
19.
《中国兽医杂志》2017,(7)
为了同步检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因1型和基因2型并能够加以区分,根据Gen Bank中已发表的BVDV基因1型和基因2型、牛蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的全基因序列,采用Primer Premier 5.0软件,针对BVDV的高度保守的5'端非编码区的核苷酸序列,设计了两对特异性引物,二重RT-PCR方法扩增目的片段的大小分别为222 bp和119 bp,经过对反应体系和条件的优化,本研究建立了在同一反应体系中鉴别检测BVDV基因1型和2型的RT-PCR方法,扩增出了与预期大小相符的目的片段。该方法便捷,特异性高,敏感性强,重复性好,可作为BVDV分型鉴定和快速诊断的有效方法。 相似文献
20.
鸡IBV、NDV和AIV多重RT-PCR检测方法的初步建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据鸡传染性支气管炎病毒M基因、禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,初步建立了针对鸡传染性支气管炎(IB)、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT-PCR鉴别诊断方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的3对引物可对同一样品中的IBV、NDV和AIV进行特异性扩增,所扩增的目的片断的长度分别为333bp(IBV)、438bp(NDV)和196bp(AIV);建立的多重RT-PCR检测方法能够检测出1ng/μLAIV、1ng/μLNDV和10ng/μLIBV的cDNA,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。本研究所建立的多重RT-PCR方法可用于上述3种鸡病毒性呼吸道疾病的快速鉴别诊断,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。 相似文献