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1.
试验旨在探讨单精子胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）法生产猪体外受精卵和应用猪ICSI受精卵进行胞质注射生产转基因胚胎的可行性。首先对比了猪体外受精（in vitro fertilization,IVF）受精卵与ICSI受精卵的胚胎发育效率;然后观察了猪ICSI受精卵的双原核形成时间及效率,对精子注射到胞质后6~18 h分6个时间段进行地衣红染色,对比精子进入卵胞质后的状态及原核形成;最后对猪IVF受精卵受精后8~10 h及ICSI受精卵受精后12~14 h进行EGFP-N1质粒（20 ng/μL）胞质注射,观察胚胎发育效率及转基因效率。结果表明,ICSI受精卵的胚胎发育率（卵裂率89.4%和67.9%、囊胚率36.5%和16.1%）显著优于IVF组（P<0.05）,适合用于猪的体外受精卵试验;猪ICSI受精卵双原核在精子注射到卵胞质后12~14 h形成,双原核形成率为54.90%,显著高于其余5个试验组（P<0.05）;ICSI受精卵胞质注射组胚胎卵裂率（86.2%和66.3%）、囊胚率（30.0%和13.6%）及转基因效率（18.5%和0）均显著高于IVF受精卵胞质注射试验组（P<0.05）。本试验结果为采用ICSI受精卵进行胞质注射生产转基因猪的研究奠定了基础。 相似文献
2.
本试验探讨了不同辅助激活方法(Calciumionophore A23187激活、Calciumionophore A23187+6-DMAP联合激活和电激活)、不同精子预处理方法(液氮冻融处理和0.1%Triton X-100处理)和在添加半胱氨酸的胚胎培养液中培养不同时间(0 h、4 h、12 h和168 h)对猪卵母细胞内单精子注射(ICSI)胚胎体外发育的影响。结果显示:与无辅助激活相比,A23187+6-DMAP联合激活和电激活均能显著提高ICSI卵母细胞的激活率、卵裂率和囊胚率(P0.05),A23187+6-DMAP联合激活能显著提高ICSI卵母细胞的受精率(P0.05)。液氮冻融精子组ICSI卵母细胞的雄原核形成率显著高于活精子组(P0.05)。在添加半胱氨酸的胚胎培养液中培养4 h的ICSI卵母细胞受精率、雄原核形成率和囊胚率显著高于0 h组(P0.05)。以上结果表明,猪卵母细胞在ICSI后需要辅助激活来启动胚胎顺利发育,A23187+6-DMAP激活效果较好。液氮冻融精子可以促进ICSI后雄原核的形成。半胱氨酸处理4 h对猪ICSI卵母细胞受精和发育均有促进作用。 相似文献
3.
单精注射法生产转GFP基因猪胚胎的研究 总被引：1，自引：1，他引：1
卵胞质内单精子注射(ICSI)的出现为治疗人类男性不育提供了新的途径。作为一种家畜胚胎工程新技术，ICSI可以解决猪的多精子受精问题。本研究用冷冻/解冻的猪精子与GFP基因孵育后对猪IVM卵母细胞进行ICSI，通过对猪ICSI卵母细胞发育能力和基因表达效率的分析，初步研究以精子为载体的转基因与卵细胞质内单精注射相结合的技术(SMGT-ICSI)生产转基因猪胚胎的技术路线的可行性。用GFP基因转染的精子注射后化学激活的ICSI卵母细胞基因表达率显著高于电激活处理的ICSI卵母细胞的基因表达率。用精子头部注射的猪卵母细胞和用完整精子注射的猪卵母细胞总基因表达效率无显著差异(P>0.05)。结果表明，用冷冻/解冻后的猪精子或精子头部与外源DNA孵育后通过ICSI方法生产转基因胚胎是可行的。 相似文献
4.
为探讨猪精子、水牛精子及食蟹猴精子分别注入到猪卵母细胞后原核形成及早期胚胎发育情况,利用屠宰场收集的猪卵母细胞,经体外成熟44～48h后,进行胞质内显微受精(ICSI)操作。试验1:体外培养18～19h,用Ho-echst33342荧光染色,检查原核形成情况。试验2:进行体外培养,ICSI后2d检查分裂率,7d记录囊胚率。试验1结果显示:在原核形成率上,猪同种显微受精,原核形成率(50.10%)显著高于注入水牛精子(37.06%)及食蟹猴精子(37.48%),且差异显著(P0.05),注入水牛精子和食蟹猴精子间差异不显著。试验2结果显示:猪同种显微受精所得的分裂率(86.58%)和囊胚率(29.93%)与水牛精子注入(70.98%,18.48%)、食蟹猴精子注入(78.69%,16.92%)差异显著(P0.05)。结果表明,水牛精子、食蟹猴精子分别注入到猪卵母细胞后,观察到雌雄原核和精子解聚;水牛精子注入猪卵母细胞与食蟹猴精子注入猪卵母细胞,经体外培养发育到囊胚。 相似文献
5.
本研究旨在探讨不同的联合激活处理、精子预处理方法和单精子注射方式对奶牛分离精子ICSI效率的影响。借助显微操作仪将经不同预处理的奶牛分离X精子直接注入体外成熟22～24h的牛卵母细胞胞质内,注射过程采用回吸胞质和不回吸胞质2种处理,最后分别用3种激活方案对注射卵进行激活。结果表明:用CR1aa+Ionomycin+6-DMAP对ICSI注射卵进行激活后,卵裂率和囊胚率都高于A23187+CHX和7%ET+CHX两种联合激活组(63.74%vs61.09%、53.75%;28.54%vs17.68%、22.00%,P0.05);采用percoll密度梯度离心法处理精子,卵裂率(77.10%vs62.19%,P0.05)与囊胚率(26.95%vs22.82%,P0.05)均高于上游法处理组;ICSI时回吸胞质获得的注射卵,其卵裂率和囊胚率均显著高于不回吸胞质处理组(63.10%,25.35%vs41.56%,19.40%,P0.05)。结果表明,用percoll密度梯度离心法处理精子、注射时回吸胞质、用CR1aa+Iono-mycin+6-DMAP激活ICSI注射卵,可显著提高奶牛分离精子ICSI的效率。 相似文献
6.
实验研究了不同成熟培养时间的牛卵母细胞玻璃化冷冻及胞质内单精子注射(ICSI)后的受精效果。结果表明:成熟后的新鲜牛卵母细胞按照ICSI注射方法穿刺而不注射精子组与未经穿刺的对照组相比,孤雌激活后的卵裂率、囊胚发育率及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05);成熟培养16h(MⅠ)和23h(MⅡ)卵母细胞冷冻解冻后形态正常率均显著低于新鲜对照组(76.66%、87.33%vs100.0%)(P<0.05),冷冻解冻后二者分别成熟培养至24h,ICSI后胚胎的囊胚发育率(5.29%、14.41%)显著低于新鲜对照组(24.40%)(P<0.05);成熟培养23h与成熟培养16h的卵母细胞冷冻解冻后形态正常率及ICSI后囊胚发育率(14.41%vs5.29%)均有显著性差异(P<0.05)。实验证明,ICSI操作不会影响卵母细胞发育潜力;玻璃化冷冻影响卵母细胞解冻后形态正常率以及ICSI后胚胎的发育能力;成熟培养23h比16h的卵母细胞冷冻保存后经ICSI的胚胎发育潜力高。 相似文献
7.
精子不同处理和胰岛素不同浓度对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
探讨了分别使用新鲜、冷冻和超声波断尾精子以及在胚胎培养液中分别添加不同浓度胰岛素对猪卵母细胞胞质内单精子显微受精(ICSI)胚胎早期发育的影响.结果:(1)使用冷冻解冻精子与新鲜精子相比对猪卵母细胞ICSI后的卵裂率和囊胚率均无显著影响(P＞0.05);2)精子断尾与否对猪卵母细胞ICSI后的分裂率和囊胚率没有显著影响(P＞0.05);3)在胚胎培养液中添加5 mg/L胰岛素与对照组相比可显著提高猪ICSI胚胎的囊胚发育率(18.22% vs 3.60%,P＜0.05). 相似文献
8.
水牛精子在胞质内注射后的早期形态变化 总被引：1，自引：0，他引：1
应用胞质内精子注射 (intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术探讨了水牛卵母细胞胞质与注射精子间的相互作用以及 ICSI精子的形态变化。ICSI后 13h,5 9.4 %的精子头部已膨大 ,且有 18.8%的精子进入解聚状态。雌雄原核发育不同步 ,雄原核在 ICSI后 16 h和 19h的形成率分别为 3.2 %和 4 0 .0 % ;雌原核在 ICSI后 13h已达到 71.9% ,16 h时提高到 90 .3%。经离子霉素与 6 - DMAP联合激活 ,ICSI后 19h产生的胚胎核型以 2 PN PB1 为主 ,其雌原核形成 (激活 )率为 91.3% ,雄原核形成率为 4 0 .0 % ,5 1.3%为孤雌胚。用 5 mm ol/ L 的 DTT预处理精子 1h,可提高精子的解聚率 (30 .9%比 12 .7% ,P<0 .0 5 ) ,但对雄原核的形成率无显著影响 (33.3%比 32 .7% ,P>0 .0 5 )。结果表明 ,水牛精子 ICSI后的雄原核形成时间晚于卵子雌原核形成时间 ,且其比率低于卵子 ,DTT处理精子能提高其解聚率 ,但对雄原核形成无影响 相似文献
9.
影响猪ICSI转基因技术效率的主要因素研究 总被引：2，自引：0，他引：2
以猪体外成熟卵子和冷冻解冻的死精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨注射台温度、激活后6-DMAP的处理和精子与PEGFP-N1孵育液添加BSA(牛血清白蛋白)对精子胞质内注射(ICSI)转基因效率的影响。结果表明:注射台温度为30℃时的阳性率为40.07%,而38.5℃时为20.97%,差异极显著(P<0.01)。添加BSA的囊胚转基因率为55.56%,对照组为33.33%,差异极显著(P<0.01)。6-DMAP处理组与对照组的转基因率分别为52.53%和26.25%,差异极显著(P<0.01);而且6-DMAP处理组的囊胚率(9.96%)显著高于(P<0.05)对照组(2.30%)。研究表明注射台温度对转基因效率有明显影响,温度高转基因率低;精子与PEGFP-N1孵育液添加BSA对转基因胚胎发育有一定促进和保护作用,有利于提高囊胚转基因率;激活后用6-DMAP处理能提高转基因率和囊胚率。 相似文献
10.
11.
本试验以奶水牛为研究对象,探讨卵胞质内单精子注射(ICSI)操作液中添加不同浓度聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、细胞松弛素(CB)、透明质酸(HA)对早期胚胎发育的影响。旨在探寻一套适合奶水牛ICSI的操作程序,为高效生产奶水牛体外胚胎提供科学依据。结果表明:4%PVP组卵裂率高于6%PVP组和8%PVP组(65.8%vs59.5%、44.4%,P<0.05);4%PVP组囊胚率高于6%PVP组(21.0%vs16.2%,P<0.05)和8%PVP组(21.0%vs8.3%,P<0.01);添加CB组的卵裂率高于未加CB组(73.3%vs68.9%,P>0.05),添加CB组囊胚率高于未加CB组(22.2%vs20.0%,P<0.05);操作液中添加1.5mg/mLHA更有利于胚胎的发育。1.5mg/mLHA组和4%PVP组相比较,操作过程中润滑作用相似,HA组卵裂率略高于PVP组(71.0%vs65.8%,P<0.05);HA组囊胚数略高于PVP组(22.6%vs21.0%,P>0.05)。 相似文献
12.
为提高性控犏牛胚胎体外发育率,从性控精液的精子密度、受精时间、卵丘细胞的脱除程度、胚胎培养体系和胚胎培养环境各个环节进行优化。结果表明:(1)受精24h的卵裂率和囊胚率显著高于受精6h、18h(P0.05);(2)性控精液的精子密度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL时的卵裂率显著低于4×10~6~6×10~6个/mL组(P0.05),但囊胚率差异不显著(P0.05),均显著高于性控精液0.04×10~6~0.06×10~6个/mL的卵裂率和囊胚率(P0.05);(3)卵丘细胞不脱除组的囊胚率(23.42%)显著高于半脱除组(13.77%)和完全脱除组的囊胚率(15.61%)(P0.05);(4)输卵管上皮细胞共培养的囊胚率(24.63%)和卵丘细胞共培养的囊胚率(23.42%)差异不显著(P0.05),但均显著高于FBS CR1aa培养液的囊胚率(P0.05);(5)性控犏牛早期胚胎在低氧培养环境下囊胚率(23.42%)显著高于高氧培养环境(11.83%)(P0.05),而孵化囊胚率差异不显著(P0.05)。结果说明,生产性控犏牛胚胎最佳的条件是性控精液的浓度0.4×10~6~0.6×10~6个/mL,受精时间为24h,采取卵丘细胞不脱除的方法,胚胎培养方式采用输卵管上皮细胞共培养的方式,胚胎培养环境采用低氧环境。 相似文献
13.
猪体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术效率的不稳定性限制了该技术在畜牧生产中的应用。本研究比较了精子获能前后的状态和活精子数之间的关系;精子获能后的浓度和状态对IVF后胚胎卵裂率、囊胚率的影响;不同个体来源的精子混合后对IVF卵裂率、囊胚率的影响。结果表明:精子获能前后,活精子数无显著性差异(P>0.05);检测精子的浓度与状态与卵裂率、囊胚率无直接关联;利用混合精子进行IVF,单一精子所得到的IVF囊胚率分别是A17.00%、B 12.24%、C 33.00%、D 4.81%、E 10.00%、F 22.00%,混合精子的囊胚率分别是A+B 77.00%、C+D 67.01%、E+F 35.50%,混合精子和单一精子的囊胚率差异不显著。 相似文献
14.
本实验以猪体外成熟卵子以及冷冻解冻后失活的精子为材料,以无BSA且成分明确的TL-HEPES溶液为操作液,探讨显微注射过程中分别使用钝口针和磨口针进行注射,对猪卵子的激活、ICSI胚胎的发育及EGFP表达效率的影响。结果表明:成熟后的猪卵子在不进行精子注射和电激活的情况下,使用钝口针空注射后,卵裂率显著高于磨口针(P<0.05)。分别使用钝口针和磨口针对成熟后的猪卵子进行精子注射,不论进行或不进行电激活,使用钝口针注射,卵子的卵裂率、囊胚率和胚胎EGFP的表达效率均显著高于磨口针(P<0.05)。本实验研究发现,使用钝口针进行注射有利于猪ICSI卵子的激活,胚胎的发育以及胚胎中EGFP表达效率。 相似文献
15.
为了进一步优化猪胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）胚胎制备条件,本试验将Piezo操作系统应用于猪ICSI胚胎制备过程中,并以胚胎各阶段存活率、分裂率和囊胚率作为衡量指标,对比Piezo操作系统与传统斜口针操作、Piezo操作条件时操作液中添加CB浓度、操作台温度及精子的不同处理方法对猪ICSI胚胎发育的影响。结果表明,Piezo操作系统可以显著提高注射卵的存活率和卵裂率（P<0.05）,但对囊胚率没有显著影响（P>0.05）;利用Piezo进行猪ICSI时,操作液中添加CB,可以减少显微操作时注射针卵母细胞的损伤,其中以7.5 μg/mL CB效果最佳;操作台温度30℃最适合制备猪ICSI胚胎;精子预先进行超声波断尾处理对猪ICSI胚胎的早期发育无显著影响。研究结果表明,精子预先进行超声波断尾处理后,操作液中添加7.5 μg/mL CB、操作台温度30℃,应用Piezo操作系统比较适合猪ICSI胚胎制备。 相似文献
16.
《畜牧兽医学报》2020,(4)
旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响。本试验从健康母猪卵巢上抽取卵母细胞进行体外成熟培养,将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂组(16～22 h)与晚期卵裂组(26～32 h)统计比较卵裂率和囊胚率,并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。结果表明,猪孤雌激活胚胎在16～22 h发生卵裂的为50%～60%,而26 h之后发生卵裂的不到20%,在18 h前完成第一次卵裂的胚胎囊胚发育率为79%,42 h后发生初次卵裂的胚胎无法发育至囊胚期。猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组(P0.05)。早期卵裂组囊胚的Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因的表达量显著高于晚期卵裂组(P0.05),Oct4、Sox2、Klf4基因的相对表达量极显著高于晚期卵裂组(P0.01),Bax和Caspase-3基因的相对表达水平极显著低于晚期卵裂组(P0.01),而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎(26～32 h)显著上调(P0.05)。结果显示,初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于较晚卵裂胚胎,其囊胚多能性相关基因表达上调,凋亡相关基因表达下调,卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数。 相似文献
17.
多精子受精指多于一个的精子进入卵母细胞的胞质中，导致多倍体合子的形成、早期胚胎发育夭折或发育异常。哺乳动物在正常的体内受精中多精受精只占1％～2％，当猪卵母细胞在体外成熟和受精时，多精子受精率明显比体内成熟猪卵母细胞的高。多精子受精而发育的猪早期胚胎可发育至囊胚阶段甚至可以更进一步发育，但和两原核正常胚胎相比它们的囊胚内细胞团细胞数明显减少。 相似文献
18.
试验采用不同浓度的DTT或GSH预处理猪精子,统计ICSI后精核解聚率、雄原核形成率及胚胎发育情况.结果表明,①精核解聚率随DTT浓度的增加而提高,6 mmol/L DTT处理组的2PN 2Pb形成率(P＜0.01)和卵裂率(P＜0.05)均高于其余各组.随着DTT浓度的增加,囊胚总细胞数呈现下降趋势.表明6 mmol/LDTT预处理精子的ICSI效果较好,但DTT在促进精核解聚的同时所产生的副作用在一定程度上影响了ICSI胚胎的后期发育;②随着GSH浓度的升高,注射卵母细胞的2PN 2Pb形成率、MPN形成率和精核解聚率均呈上升趋势.0.5 mmol/L GSH处理组的卵裂率高于其余处理组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01),囊胚发育率显著高于对照组(P＜0.05).说明0.50 mmol/L GSH处理组的ICSI效果较好;③0.5 mmol/L GSH处理组的2PN 2Pb形成率、卵裂率和囊胚总细胞数极显著高于6 mmol/LDTT处理组(P＜0.01),两者MPN形成率差异显著(P＜0.05).表明0.5 mmol/L GSH预处理精子的ICSI效果要好于6 mmol/L DTT. 相似文献
19.
《畜牧与兽医》2019,(12):19-24
应用体外受精(in vitro fertilization, IVF)等生物技术可以缩短种猪培育时间,地方猪精液的冷冻保存可以解决保存和运输问题。通过对不同个体冷冻前后的精子质量、获能方式、卵子质量及多精受精率对IVF的影响进行了研究。结果显示:当精子活率从83.26%降至74.20%时,IVF的卵裂率、桑椹胚率显著下降(P0.05)。不同的获能方式对IVF胚胎的卵裂率无显著影响(P0.05)。3层(及以上)卵丘细胞的卵子IVF的卵裂率、桑椹率显著高于3层以下组(P0.05)。冷冻精子的IVF中,2-细胞、4-细胞和囊胚的发育能力显著低于新鲜精子(P0.05),受精后6～12 h的多精受精率也显著高于新鲜精子组(P0.05)。猪体外受精胚胎的发育能力受精子和卵母细胞的影响。无论使用新鲜精液还是冷冻精液的IVF胚胎,在桑椹胚期后的发育能力都会受到阻碍,多精受精可能是原因之一,但具体原因还需要更多的研究。 相似文献
20.
《中国兽医学报》2017,(4):728-734
猪卵母细胞体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术为受精和胚胎早期发育机理等基础理论的研究及生产实践提供了重要的研究手段。虽然猪IVF的研究已经取得了一些进展,但其囊胚发育率仍然较低,亟需建立更为稳定、高效的体外受精方法。本试验通过比较精子浓度,精子获能处理,不同精卵共孵育培养体系以及在卵母细胞成熟过程中添加不同激素等影响猪卵母细胞体外受精胚胎发育能力的因素,以求找到最佳的猪卵母细胞体外受精体系。结果显示:在精子浓度为1×10~5~1×10~7/mL,5×10~6/mL的精子浓度显著提高体外受精效率(P<0.05);以茶碱、咖啡及咖啡因联合使用肝素作为获能物质处理精子,发现2.5 mmol/L茶碱处理组体外受精效率显著提高(P<0.05);通过比较不同的受精体系,发现使用40个卵/500μL体系显著提高体外受精效率(P<0.05);在卵母细胞成熟液中添加不同激素组合,发现添加10IU/mL PMSG,10IU/mL HCG和2.5IU/mL FSH激素组合,体外受精效率显著提高(P<0.05)。本试验结果表明,在M199中添加10IU/mL PMSG,10IU/mL HCG和2.5IU/mL FSH体外成熟培养卵母细胞,以5×10~6/mL精子浓度,2.5mmol/L茶碱作为获能物质处理精子,40个卵/500μL共孵育的IVF体系效果最佳,其卵裂率为(61.33±0.77)%,囊胚率为(28.33±1.08)%。本试验将为深入研究猪IVF提供理论参考。 相似文献