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1.
章卓 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2010,36(3):339-343
以致病性嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)人工感染的草鱼肠道组织为材料,采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织消减cDNA文库,对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得147个草鱼肠道表达序列标签(EST).序列同源性搜索结果表明,97个EST代表了46个已知基因,其余50个EST为未知序列.与细胞防御相关的EST有43个,分属13个基因. 相似文献
2.
[目的]研究溃疡病菌诱导下毛白杨防御相关基因的应答反应.[方法]以毛白杨为试验材料,用溃疡病菌对7月龄幼苗进行接种,提取诱导前后的毛白杨树皮mRNA,通过反转录生成cDNA,构建72 h差异表达的SSH-cDNA文库.随机挑选199个阳性克隆进行测序,将测序结果与NCBI基因库中序列进行比较,并对这些EST在dbEST数据库进行同源检索分析,利用RT-qPCR对文库中7个基因进行进一步分析.[结果] 172个EST找到了同源序列,其中有32个序列与防御相关.在毛白杨受到溃疡病菌诱导时,这些防御基因的表达量明显上升.[结论]该研究为开展毛白杨抗溃疡病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础. 相似文献
3.
绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。 相似文献
4.
陆地棉显性无腺体近等基因系SSH文库的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]应用抑制性消减杂交技术构建差异表达cDNA消减文库。[方法]以显性无腺体中棉所12（显无中12）和中棉所12（中12）提取棉花总RNA,以显无中12为驱动子,中12为检测子,利用SSH法建立差异表达cDNA文库进行克隆,并以NestedPcRPrimer1和2R对插入片段进行PCR扩增,分别以显无中12和中12总cDNA为探针进行反向Northern杂交,筛选差异表达克隆,进行序列相似性分析。[结果]通过建立差异表达cDNA文库共获得2280个克隆,通过反向Northern杂交共筛选363个差异表达克隆,测序后得到299个质量合格的EST序列,共56个重叠群,91个单拷贝。这些EsT所涉及的基因,主要是与代谢和次生代谢调节、生物合成、细胞凋亡、信号传导等有关联的cDNAs。[结论]SSH文库的构建和分析为显性无腺体形成相关基因的克隆和结构功能研究奠定了基础。 相似文献
5.
【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。 相似文献
6.
[目的]构建烟草打顶后根尖组织的消减文库,寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因.[方法]以打顶株为测验子(tester)、以非打顶株为驱赶子(driver),利用抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization,SSH)和反向Northern杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库,并对差异表达克隆进行生物信息学分析.[结果]构建了具有高消减效率的cDNA文库.PCR验证消减文库阳性克隆的插入片段为200-1 000 bp.经反向Northern杂交,从850个克隆中筛选到560个杂交信号差异明显的克隆,测序后得到273条有效序列.对273个已知功能基因的ESTs进行分类,生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转导和转录因子类占18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%,碳代谢占6%、其它代谢占15%,功能未知类占13%.RT-PCR结果显示,NTAT84和NTAT71序列在烟株打顶后转录活性均升高.[结论]应用SSH技术构建了烟草打顶前后根尖组织消减cDNA文库. 相似文献
7.
[目的]筛选出奶牛Y-X精子差异表达基因.[方法]利用固相磁珠扣除杂交技术分选高纯度奶牛Y精子对X精子的表达基因,获得的差异片段经SMART扩增后构建Y精子对X精子消减杂交cDNA质粒库,克隆测序,在线进行序列同源性分析.[结果]筛选出的4条候选基因均与牛EST数据库中的序列高度同源,其中之一确认为牛Sry基因,其余3条牛未知功能基因.[结论]基于磁珠上的固相扣除杂交技术有利于简单快速的富集差异表达基因,可用于筛选奶牛Y-X精子候选差异表达基因. 相似文献
8.
9.
【目的】构建小麦D基因组供体粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用Cap-trapper方法构建全长cDNA文库，利用高通量测序技术获得大批高质量EST序列，在基于Linux系统的本地化生物信息学分析平台上对上述EST进行了电子注释分析。【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，测序获得根EST序列6 973条和叶EST 6 616条。利用本地化数据分析平台对其进行功能注释。利用GO-Diff软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长cDNA测序获得大量EST序列，通过生物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。 相似文献
10.
LUO Hai-bin CAO Hui-qing WEI Yuan-wen DENG Zhi-nian PAN You-qiang GUO Yuan-yuan HE Hai-bo LI Yang-rui 《广西农业科学》2012,43(6)
[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95％,文库插入片段长度在500～2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5％和93.5％.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87％;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13％.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因. 相似文献
11.
[目的]构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减c DNA文库,对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。[方法]以水稻IR26(Tester)和两优培九(Driver)幼苗5~6叶期叶片为材料,采用双链特异性核酸酶(DSN)介导的均一化消减杂交技术,构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减c DNA文库,以p LB-F和p LB-R为引物,通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果]c DNA文库的插入片段分布在0.5~2.0 kb,平均大小约为1.0 kb,重组率达95%。序列测定分析发现,随机挑取的504个克隆中有98条差异表达基因;经BLAST比对和GO注释发现,59条序列具有同源基因,分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等;另外39条序列无相似基因,有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现,从该文库中分离得到的Os NDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的c DNA文库质量较好,为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。 相似文献
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一种改进的固相扣除杂交法直接克隆全长差异表达基因 总被引：1，自引：0，他引：1
该文集多种分离差异表达基因方法的优点于一体,自行优化了一种基于固相扣除杂交和聚合酶链式反应(PCR)技术直接克隆全长差异表达基因的策略．该策略中的所有操作步骤,包括poly (A)+mRNA的分离,cDNA的合成和扣除杂交都是在磁珠上进行的,操作简单易行．扣除杂交是用结合在磁珠上的以oligo(dT)为引物合成的对照材料（Driver）的cDNA第一链,直接扣除加有接头的处理材料（Tester）cDNA第二链中的共有序列．多次反复使用Driver一链与Tester二链进行杂交,能有效去除Tester二链中的共有序列.磁珠的分离能最小限度地减少每次杂交造成的损失．最后一轮扣除后的Tester二链中,含有大量差异表达序列,用Tester二链特有的接头引物进行扩增,能进一步提高扣除效率．该文选用此扣除方法,成功分离到了低温驯化沙冬青幼苗和对照苗2个群体的18个差异表达克隆,其中有4个克隆是全长cDNA序列．经序列分析发现,这些基因都与低温相关,进一步说明,该方法可用于克隆未知差异表达基因． 相似文献
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棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs,GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank登录号为FJ848869)分别具有1101bp、1098bp、1071bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2mmol·L-1IPTG在37℃下诱导6h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。 相似文献
14.
[目的]构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,对细胞功能相关基因表达进行初步分析。[方法]提取处理玉米YQ7-96品系的雌雄分化期（12片叶龄）的混合组织（叶、茎和花芽）总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的B lastX比对和MIPS归类分析。[结果]随机挑取3 027个cDNA克隆进行测序,94.45%的EST长度大于400 bp,共获得1 861个单基因簇,其中维持正常生理活动的基因占65.36%;参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别占9.26%、6.58%、2.63%和3.16%。[结论]在成功构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库的基础上,对产生的EST进行了测序和分析归类,筛选出了细胞功能相关EST,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。 相似文献
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[目的]研究在不同种植密度下棉花生长状况、棉铃特征和产量变化,为沿江棉区找寻高产优质的合理种植密度提供理论参考。[方法]以湘杂棉8号为试验材料,起始密度为12000株/hm2,密度梯度为9000株/hm2,共设6个处理。研究其生长周期、产量、棉铃、棉纤维等特征变化。[结果]密度对棉花的株高和其各生长周期影响不大,不同密度处理中籽棉衣分、纤维品质差异不明显,但对单铃重、＂三桃＂分布、蕾铃脱落率、僵烂比及产量等均有较大影响,且差异显著。基本规律为：棉花单铃重和伏桃比随着种植密度增加而降低,脱落率和僵烂比随着密度增加而增加;但都在处理5时表现最差。皮棉产量以处理2、3和4较高,最高的为处理3,密度最低的处理1产量最低。[结论]通过试验数据分析,在沿江棉区种植杂交抗虫棉以30000株/hm2的种植密度最佳。 相似文献
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WANG Li-na WU Dong YU Shu-xun FAN Shu-li SONG Mei-zhen PANG Chao-you LIU Jun-jie 《中国农业科学(英文版)》2011,10(1):28-40
A full-length normalized cDNA library for the flower development stages of short-season cotton(Gossypium hirsutum L.)(CCRI36)was constructed.A total of 3 421 clones were randomly selected for sequencing,with a total of 3 175 effective sequences obtained after removal of empty-carriers and low-quality sequences.Clustering the 3 175 high-quality expressed sequence tags(ESTs)resulted in a set of 2 906 non-redundant sequences comprised of 233 contigs and 2 673 singletons.Comparative analyses indicated that 913(43.6%)of the unigenes had homologues with function-known genes or functionassumed genes in the National Center for Biotechnology Information.In addition,763(36.4%)of the unigenes were functionally classified using Gene Ontology hierarchy.Through EST alignment and the screening method,the full-length cDNA of two MADS-box genes viz.,GhMADS11 and GhMADS12 were acquired.These genes may play a role in flower development,Phylogenetic analysis indicated that GhMADS11 and GhMADS12 had high homology and close evolutionary relationship with AGL2/SEP-type and PI-type genes,respectively.The expression of both GhMADS11 and GhMADS12,genes was high in reproductive organs.In floral organs,GhMADS11 expression was high in petals(whorl2)and ovules,while GhMADS12 expression was high in petals(whorl2)and stamens(whorl3).Results show that the EST strategy based on a normalized cDNA library is an effective method for gene identification.The study provides more insights for future molecular research on the regulation mechanism of cotton flower development. 相似文献
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[目的]构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,对细胞功能相关基因表达进行初步分析。[方法]提取处理玉米YQ7-96品系的雌雄分化期(12片叶龄)的混合组织(叶、茎和花芽)总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的BlastX比对和MIPS归类分析。[结果]随机挑取3 027个cDNA克隆进行测序,94.45%的EST长度大于400 bp,共获得1 861个单基因簇,其中维持正常生理活动的基因占65.36%;参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别占9.26%、6.58%、2.63%和3.16%。[结论]在成功构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库的基础上,对产生的EST进行了测序和分析归类,筛选出了细胞功能相关EST,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。 相似文献
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构建cDNA文库是发掘基因和研究基因功能的重要工具,也是基因组学研究的重要技术手段。棉花作为世界上重要的经济作物之一,研究人员已经构建了大量的棉花cDNA文库,为棉花基因发掘和功能研究积累了丰富的Expressed Sequence Tags(ESTs)资源。本文对近几年来cDNA文库在棉花基因发掘中的应用进行了总结。 相似文献