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二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)是催化嘧啶从头合成途径中的关键酶,由于顶复门原虫等低等生物与其宿主的DHODH在分子结构上的差异,可以作为研发新型抗顶复门原虫药物的靶标而成为研究的热点.本研究利用电子克隆策略,以疟原虫DHODH氨基酸基因序列为信息探针,搜索球虫基因库(www.sanger,ac.uk/projects/E-tenella/),拼接注释了柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)DHODH的基因序列,以E.tenella广东株第2代裂殖子总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得EtDHODH ORF基因序列.构建重组表达载体pCold Ⅰ-EtDHODH,进行原核表达.测序结果显示,EtDHODH的基因大小为1254 bp,SDS-PAGE鉴定结果表明,目的蛋白约45 ku.本研究重组表达并纯化了EtDHODH基因,为建立以EtDHODH为靶点的抗球虫药物筛选奠定了基础. 相似文献
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《畜牧与兽医》2016,(10):7-12
为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)组蛋白去乙酰化酶2A(Et Sir2A)的生化功能及其对生活史发育的潜在调节作用,以柔嫩艾美耳球虫甘肃株为例,检测其在不同发育阶段表达量的差异。以基因组数据预测的编码序列为模板设计引物,采用RT-PCR的方法扩增得到Et Sir2A的全长ORF,构建p MAL-C2X-Et Sir2A重组表达质粒并进行原核表达;提取未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段/时期的总RNA,采用qRT-PCR方法检测Et Sir2A的转录动态变化。测序结果显示,克隆的Et Sir2A ORF序列全长909 bp,编码302个氨基酸,并能在大肠杆菌原核系统中成功表达;qRT-PCR结果显示,Et Sir2A在不同发育阶段mRNA转录水平差异显著,在未孢子化卵囊阶段最高,第二代裂殖子阶段最低。结果为进一步研究Et Sir2A功能和开发新型抗球虫药物提供了数据基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2017,(11)
蛋白质翻译后O-糖基化修饰普遍存在于真核生物、细菌和古细菌,多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferase 2,ppGalNAc-T2)是O-糖基化反应的限速酶。基因组数据分析揭示艾美耳球虫具有O-糖基化反应途径。为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)蛋白质翻译后糖基化修饰及其关键酶的药靶效用,对Et ppGalNAc-T2基因进行了克隆,并检测其在E.tenella不同发育阶段的表达动态。根据EuPathDB中所预测Et ppGalNAc-T2基因序列设计引物,以RT-PCR方法扩增获得Et ppGalNAc-T2的ORF,插入酶切位点后连接到原核表达载体pGEX-6p-1进行诱导表达。提取E.tenella广东株未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段的总RNA,以qRT-PCR法检测Et ppGalNAc-T2转录水平的动态变化。结果表明,Et ppGalNAc-T2的全长ORF为1 983bp,编码660个氨基酸,在E.coli Transetta(DE3)可溶性表达。qRT-PCR结果显示,Et ppGalNAc-T2转录水平随发育阶段不同而有显著差异,子孢子阶段表达水平最高、而在孢子化卵囊则几近不能检出。结果为进一步研究EtppGalNAc-T2的功能提供了试验基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(3):448-453
为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)细胞色素bc 1复合物(cytochrome bc1,Cytbc1)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据EupathDB已公布的E.tenella Houghton株Cytbc1基因序列(Contig ID:ETH 00007855)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtCytbc1基因序列,并将其克隆到表达载体pCold43a中,构建重组质粒pCold43a-EtCytbc1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,EtCytbc1的ORF序列(687bp),编码228个氨基酸;重组菌pCold43a-EtCytbc1能成功诱导表达,pCold43a表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。 相似文献
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为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,G6-PI)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据NCBI已公布的E.tenella Houghton株G6-PI的基因序列(GI:298161921)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtG6-PI基因序列,并将其克隆到表达载体pColdI、pCold43a中,构建重组质粒pColdIEtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,E.tenella G6-PI的ORF序列(1650 bp),编码550个氨基酸;重组菌pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI均能成功诱导表达,其中pCold43a-EtG6-PI表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫G6-PI基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(19)
为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)海南(HN)株3-1E基因的遗传变异情况,试验根据GenBank发表的鸡堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因cDNA序列(登录号为AF113613)的开放阅读框(ORF)设计1对引物,采用RT-PCR方法从E.tenella HN株总RNA中扩增3-1E基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,并与已发表的E.tenella相关序列进行比较。结果表明:E.tenella HN株3-1E基因全长为513 bp,与已发表的国内外虫株的3-1E基因序列相比,核苷酸有5个位点发生变化,其中有4个位点的变化引起氨基酸发生改变,还有1个位点的变化未引起相应氨基酸发生改变。经系统发育树分析发现:同种间比较,E.tenella HN株3-1E基因与E.tenella sporozoite antigen株的遗传关系最近;同属间比较,E.tenella HN株3-1E基因与E.acervulina US株的遗传关系最近。 相似文献
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应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(11):2173-2178
为研究HB株柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)AMA-1基因的免疫原性,根据GenBank收录的AMA-1基因序列设计了1对引物,对HB株E.tenella的AMA-1基因进行克隆,应用生物信息学分析软件预测AMA-1基因的核苷酸及编码的蛋白质的结构和功能。连接pPIC9载体,并与细胞因子IL-2串联,构建真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1,转化毕赤酵母细胞GS115,进行蛋白表达及纯化验证。结果显示,HB株E.tenella AMA-1基因全长为1 617 bp,编码535个氨基酸,具有跨膜区及信号肽。经酶切和测序鉴定表明,真核表达载体pPIC9-IL-2-AMA-1构建成功。毕赤酵母转化结果表明,成功将重组载体转化到毕赤酵母中,PCR鉴定得到2 200,2 100 bp 2条带。Western blot检测结果表明AMA-1在毕赤酵母中得到了很好的表达。本试验结果为AMA-1基因的功能和核酸疫苗的研制提供依据。 相似文献