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1.
草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。 相似文献
2.
Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，实验扩增了S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞(CIK)后感染Ⅱ型GCRV，收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA。结果显示，过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒，纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体，用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白，结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线，建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒，结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从3个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖，有助于深入解析VP35蛋白功能，也为进一步探究Ⅱ型GC... 相似文献
3.
《淡水渔业》2021,51(4)
通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建。采用Ⅱ型GCRV分别接毒CiLamR稳定表达EPC和CIK,检测接毒后Ⅱ型GCRV拷贝数差异,研究草鱼37 kDa/67 kDa层粘连蛋白受体(37 kDa/67 kDa laminin receptor, LamR)对Ⅱ型GCRV增殖的影响。结果显示:经PCR扩增获得927 bp CiLamR完整开放阅读框(ORF),并成功克隆进入真核表达质粒pEYFP-Mem,获得pEYFP-Mem-CiLamR重组质粒,转染并经过G418筛选后获得约80%阳性荧光的细胞。Western Blot证实稳定表达CiLamR的EPC和CIK细胞系构建成功。以不同初始浓度接种EPC-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR细胞均未检测到Ⅱ型GCRV增殖,CIK-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR可检测到病毒增殖,但是增殖量无明显差异。结果表明:CiLamR蛋白对基因Ⅱ型GCRV增殖无明显影响。 相似文献
4.
为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白VP56与宿主蛋白的相互作用,实验采用酵母双杂交Gal4系统鉴定与VP56相互作用的草鱼蛋白。首先利用RT-PCR技术从Ⅱ型GCRV感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因VP56,构建p GBKT7-VP56诱饵表达载体;在酵母菌株中检测其自激活性后,以VP56为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株,并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼JAM-A(Gc JAM-A)基因,并构建p GADT7-Gc JAM-A载体,在酵母中研究草鱼Gc JAM-A与病毒蛋白VP56相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒p GBKT7-VP56无自激活作用,可以应用于酵母双杂交筛选;从草鱼肾细胞文库中筛选得到9株阳性克隆,基因测序及序列分析确定其中包含草鱼7个细胞内蛋白和1个细胞外基质蛋白;VP56蛋白与Gc JAM-A蛋白在酵母中不能发生相互作用。本研究初步确定了与Ⅱ型GCRV蛋白VP56存在潜在相互作用的宿主蛋白,为深入探讨VP56蛋白在Ⅱ型GCRV感染宿主过程中的生物学功能奠定了基础。 相似文献
5.
草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。 相似文献
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酵母双杂交系统用于WSSV粘附蛋白VP37相关蛋白基因的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究WSSV的粘附蛋白VP37相关蛋白的基因，应用酵母双杂交系统Ⅲ筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。构建VP37基因的重组载体PGBKT7-VP37，把它转化酵母Y187后与含文库质粒的酵母AH109配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。经过PCR鉴定确定了1个阳性克隆。测定该段cDNA序列并进行生物信息学分析，结果显示，此cDNA片段编码的蛋白与蛋白酶的同源性较高，该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。成功筛选了VP37相关蛋白的cDNA片段，为研究WSSV入侵以及感染致病的机制等方面提供了新线索。 相似文献
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草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。 相似文献
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为研究II型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)病毒样颗粒(viruses-like particles, VLPs)疫苗,本试验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(baculovirus expression vector system, BEVS)将编码VP35蛋白的GCRV-S11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTATM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示,本试验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染sf9细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)进行检测。结果显示,GCRV的3个蛋白在sf9昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径大小为65-72nm。本试验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。 相似文献
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传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统构建 总被引：2，自引：1，他引：1
根据传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白的全基因序列,设计并合成引物,以IPNV(ATCC VR-1318)细胞培养毒提取的核酸为模板,对传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统进行了构建研究。结果显示:进行RT-PCR扩增得到截短的VP3基因约615 bp目的片段,将其克隆到pMD18-T Simple载体,经酶切、PCR扩增和序列测定后显示目的片段正确;将目的片段分别亚克隆到乳酸菌细胞表面表达型载体和分泌表达型载体,电转化于干酪乳杆菌,获得了阳性重组菌株。结果表明,通过本实验方法可构建表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统,为实现IPNV VP3蛋白在乳酸菌中的表达及免疫原性研究奠定了基础。 相似文献
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传染性造血器官坏死病和传染性胰腺坏死病是以感染鲑科鱼类为主的两种传染病。为克隆传染性造血器官坏死病病毒IHNVG基因和传染性胰腺坏死病病毒IPNVVP2基因,并构建其重组腺病毒载体。利用RT-PCR方法分别扩增出IHNVG基因和IPNVVP2基因,通过多基因片段同源重组技术将IHNVG基因和IPNVVP2基因克隆到pAdTrack-CMV载体上,经过线性化后与pAdEasy-1载体在BJ5183菌体内同源重组,构建出重组腺病毒质粒,经PCR及NotⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,再经PacⅠ线性化后用于转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒。通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达来监控重组腺病毒的复制情况,用western blot法分别检测糖蛋白(G蛋白)和VP2蛋白的表达,并测定重组病毒的滴度。结果显示,克隆出的IHNVG基因和IPNVVP2基因总长度为3 036 bp。该病毒在HEK-293细胞中分别表达出蛋白分子质量约为58 kD和54 kD的产物,其滴度为1.0×109.5 mL-1 TC... 相似文献
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以本实验室构建的半滑舌鳎BAC文库为基础,通过对其进行有序混合,构建了两步PCR筛选体系;对性别决定相关的sox9基因的序列设计特异性引物,筛选获得阳性单一BAC克隆。利用BAC-FISH技术将包含sox9基因的BAC克隆定位在半滑舌鳎染色体上。结果显示,sox9基因在雌、雄半滑舌鳎的一对常染色体的长臂上分别存在两个杂交信号位点,信号稳定且特异。研究证实了该文库筛选体系的有效性;首次实现了对性别相关的sox9基因在半滑舌鳎染色体上的定位,其结果为揭示sox9基因参与鱼类性别控制的机制提供了重要基础。 相似文献
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嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析 总被引：2，自引：3，他引：2
根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。 相似文献
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急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co2+柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg2+可以增强其活性。 相似文献
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大口黑鲈hepcidin真核表达载体构建及表达的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
将大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗菌肽hepcidin cDNA定向插入真核表达载体pPICZαA,通过SacI酶切线性化重组表达质粒pPICZαA-hepcidin,电转化毕赤酵母P.pastoris GS115,PCR扩增筛选,甲醇诱导表达等进行了hepcidin真核表达工程菌株的构建及诱导表达。结果显示:hepcidin cDNA成功插入表达载体pPICZαA,并整合到酵母基因组中;经甲醇诱导,RT-PCR检测显示hepcidin cDNA在酵母细胞中成功转录。 相似文献
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近年来,重组 VP28和 VP26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据GenBank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因,再用引物悬挂法将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到 VP28和 VP26基因的5￠端和3￠端。目的基因经双酶切后插入到表达载体pGAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化 X-33毕赤酵母感受态细胞,经 Zeocin 抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到VP28和VP26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载pGAPZαA组相比,VP28和VP26表达上清液组有明显的条带,证明VP28和VP26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。 相似文献
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海带雄性配子体差异表达基因片段的克隆及筛选 总被引：6，自引：0，他引：6
利用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH）获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段,将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli）JM109,构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定,电泳图谱表明插入片段大小在200～1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后,选取10个阳性克隆进行测序和序列分析,有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性,初步判断为新的基因序列,3个片段与已知脚基因和Lhcf6基因的同源性分别达到88％和98％。 相似文献
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哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达 总被引：8，自引：0，他引：8
根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物，应用聚合酶链式反应（PCR）方法，从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEM-Teasy载体，测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列，定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒pGEX-4T-OmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GST-OmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Western-blotting分析表明，它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应，提示外膜蛋白OmpK可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。 相似文献
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甲状腺激素通过与其受体结合对褐牙鲆变态起重要的调控作用,而miRNAs通过结合靶基因3′-UTR在转录后水平调节靶基因的表达。为探讨miRNAs在褐牙鲆变态中的作用,通过生物信息学方法预测褐牙鲆TRβ基因3′-UTR存在的miRNAs结合位点,并利用3′-RACE方法克隆TRβ基因的3′-UTR序列,通过体外DNA重组技术构建应用于miRNAs靶向基因检测的双荧光素酶重组报告载体,利用细胞转染和双荧光素酶报告技术分析多个miRNAs与TRβ基因的作用关系。研究结果显示,克隆得到了一段长为437 bp的褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR序列,发现3′-UTR序列上存在pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p、pol-miR-138和pol-miR-125a*的结合位点,成功构建了双荧光素酶重组报告载体,命名为pmirGLO-TRβ-3′-UTR。双荧光素酶报告分析结果表明,pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p和pol-miR-138均为作用于褐牙鲆TRβ的靶向miRNAs,而pol-miR-125a*对TRβ基因无直接的调节作用。研究结果将为后续深入研究miRNAs与TRβ在褐牙鲆变态发育中的功能及其作用机制提供基础。 相似文献