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1.
为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740 bp)、CPV(419 bp)和CPIV(559 bp)的多重PCR方法.结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV3种病毒的最低核酸检测量为1 ng/μL.临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断. 相似文献
2.
同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒多重PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测多种犬病的多重PCR方法,本研究根据GenBank登录犬瘟热病毒(CDV)的N基因序列、犬细小病毒(CPV)的NS基因序列和犬腺病毒(CAV)的E3基因序列,设计合成3对特异性引物.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV (507 bp)、CPV (287 bp)、CAV-Ⅰ (590 bp)和CAV-Ⅱ(1 027 bp)的多重PCR方法.实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测以上4种病毒,而狂犬病病毒检测为阴性;CDV、CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的最低检出限分别为101.9 TCID50、101.7 TCID50、101.7 TCID50和102.2 TCID50.利用该方法对由黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为23.33％(7/30)、CPV阳性率为20％(6/30)、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的阳性率均为3.33％(1/30),证明建立的PCR方法可以用于临床诊断. 相似文献
3.
为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的CDV N蛋白序列和CPV NS基因保守序列,设计合成2对特异性引物。通过优化反应条件,对CDV阳性病毒株反转录后的cDNA模板和CPV的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到2条与试验设计相符的669 bp(CDV)和392 bp(CPV)特异性条带,建立了同时检测CDV和CPV的双重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测这2种病毒,而对犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病毒检测均为阴性;CDV和CPV的最低检出限分别为101.8TCID50和101.4TCID50。采用该方法对在黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为30%;CPV阳性率为23.33%,表明建立的PCR方法可以用于临床诊断。 相似文献
4.
犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV(684 bp)、CPV(213 bp)和CCV(417 bp)的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)和犬副流感病毒(CPIV);敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10-2、6.0×10-2和6.7×10-2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。 相似文献
5.
为建立一种快速的犬细小病毒(CPV)病原检测方法,本试验根据GenBank上登录的CPV基因序列,在保守的VP2基因内部设计合成内外2对引物,建立了检测CPV的套式PCR方法。该方法对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCoV)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)的扩增结果均为阴性;该检测方法最低可以检测出0.1 ng的病毒核酸,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍。建立的套式PCR方法具有良好的特异性、敏感性,可以准确快速检测出极低含量的CPV,将为CPV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的检测方法。 相似文献
6.
为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。 相似文献
7.
根据犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬腺病毒2型(Canineadenovirus type2,CAV-2)GeneBank登陆的基因序列各设计一对引物,经试验条件优化,建立了检测CAV-2的PCR方法和CDV的RT-PCR方法,CAV-2可扩增1108bp片段、CDV可扩增560bp的目的片段,特异性试验表明建立的方法只能特异扩增CAV-2和CDV,不能扩增犬细小病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群、狂犬病病毒。敏感性试验表明,所建立的双重PCR方法可以扩增4.63ng总核酸量。在上述试验基础上继续优化条件建立了能同时检测CAV-2和CDV两种病毒的双重PCR检测方法,并用该方法检测来自辽宁、吉林等15家动物医院134份鼻液和眼眵样品,与商品化试纸条检测结果相比,本方法更加敏感和方便。研究结果表明,本实验建立的方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热病毒和犬腺病毒2型的快速检测和鉴别诊断。 相似文献
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为了建立一种能同时检测犬细小病毒(CPV)和犬瘟热病毒(CDV)的快速鉴别PCR方法,试验根据GenBank中登录的CPV NS1基因和CDV F基因序列设计2对特异性引物,通过综合CPV单项PCR方法与CDV单项RT-PCR方法的扩增程序,最后确定出联合PCR/RT-PCR方法的最佳退火温度、延伸时间和循环次数等反应程序,并对扩增产物进行克隆鉴定,同时进行特异性试验、敏感性试验和临床病料的检测。结果表明:建立的联合PCR/RT-PCR方法可以在一个扩增体系内同时检测两种病毒,其最佳联合PCR/RT-PCR扩增退火温度为50.8℃;经特异性分析,联合PCR/RT-PCR方法对犬副流感病毒(CPIV)、狂犬病毒(RV)、犬腺病毒(CAV)的检测为阴性;经敏感性分析,联合PCR/RT-PCR方法在模板浓度稀释到1×10~0 TCID_(50)时仍能见到较清晰的特异性条带;应用联合PCR/RT-PCR方法对延吉市36份犬病料样本进行检测,CPV阳性率为25.00%,CDV阳性率为33.33%,CPV和CDV混合感染阳性率为8.33%。说明试验建立的CPV和CDV联合PCR/RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于犬细小病毒病和犬瘟热病毒病的临床诊断。 相似文献
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为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型（canine adenovirus type 1,CAV-1）、犬腺病毒2型（canine adenovirus type 2,CAV-2）、犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）、犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）、犬细小病毒（canine parvovirus,CPV） 5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2~3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10~100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(3):407-411
为建立犬瘟热病毒(CDV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成2对通用引物和1条通用探针,通过体外转录构建绝对定量标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立CDV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达4.02拷贝/μL,比普通RT-PCR方法的灵敏度高出100倍,具有良好的重复性。对犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)核酸检测为阴性,具有很好的特异性。研究结果表明,建立的CDV荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为犬瘟热的早期诊断提供了重要的技术支撑。 相似文献
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为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感病毒(CPIV)的检测方法,依据GenBank中登录的CDV的H基因和CPIV的NP基因保守序列,设计合成扩增序列分别为593 bp (CDV H基因)、1 530 bp (CPIV NP基因)的2对引物,通过优化反应条件,建立一种能够同时检测CDV和CPIV的双重一步法RT-PCR检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法能特异地检测CDV和CPIV,其最低检测限分别为3.58×10~6拷贝/μL和1.74×10~6拷贝/μL。对51份临床疑似病料样品进行检测,同时分别采用商品化的CDV和CPIV抗原检测试剂盒进行检测,结果二者符合率为100%。该结果表明本实验所建立的双重一步法RT-PCR方法的灵敏度及特异性均较好,可用于临床相关疫病的诊断。 相似文献
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核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中与犬副流感(CPIV)同源性较近的SV5病毒N基因保守序列,利用DNAStar软件设计了一对特异性引物,能扩增265bp大小的片段,并以此建立了检测CPIV的RT-PCR方法,实验证明该对引物特异扩增CPIV;不扩增犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的四种病原的核酸。检测临床病料20份,其中2分为CPIV阳性。此法敏感性较高。是检测犬急性传染性呼吸道疾病(CIRD)中CPIV的有效的方法。 相似文献
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为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型(canine adenovirus type 1,CAV-1)、犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)、犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)、犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2～3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10～100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。 相似文献
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根据犬瘟热病毒（CDV）弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白（NP）基因序列设计了套式引物，建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明，该法可以特异扩增出CDV NP基因片段，但从RNA病毒狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬冠状病毒（CCV），DNA病毒犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒（CAV）及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明，RT-PCR可以扩增10^-6稀释度的病毒RNA，而建立的RT-nested PCR可以扩增到10。稀释度的病毒RNA，后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例，检出率达90％，明显高于RT-PCR的检出率（45％）。部分病例扩增片段的测序结果表明，CDVNP基因出现个别碱基变异。研究结果表明，建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异，适用于动物犬瘟热的快速诊断。 相似文献
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犬细小病毒PCR诊断方法的建立及对大熊猫粪便的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中登录的犬细小病毒(CPV) VP2基因序列,设计合成1对特异性引物;以CPV疫苗株为模板,建立了一种快速检测CPV的PCR检测方法,并应用于CPV诊断.结果显示,以此对引物进行PCR扩增能得到与理论设计值大小一致的342 bp的特异性条带,对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)扩增结果均为阴性;最低可检出约1.4 pg的病毒核酸;重复性试验结果表明,其检测重复性好;对45份临床宠物犬病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测拭纸捡测结果进行比较,吻合率为90.0％.将此方法初步应用于大熊猫粪便中细小病毒的检测,结果表明,从熊猫基地采集的52份正常大熊猫粪便样品中有8份为细小病毒阳性,阳性率为15.3％.大熊猫是通过自然感染还是弱毒苗感染细小病毒的机制还不清楚. 相似文献
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建立一种同时检测貂肠炎病毒(MEV)、貂阿留申病毒(ADV)和犬腺病毒(CAV)的多重PCR诊断方法.引用已有的CAV引物,并根据GenBank发表的MEV、ADV序列保守区域设计特异性引物进行PCR扩增,可同时得到扩增长度为795(MEV)、451(ADV)、1 019 bp(CAV)3奈特异性片段,对猪细小病毒(PPV),犬瘟热病毒(CDV)进行PCR检测结果为阴性.各种模板、引物之间相互不构成干扰.敏感性试验证明,可以检测到模板中MEV 101.5 TCID50和CAV 100.5 TCID50的病毒含量,对ADV检测的敏感性更高. 相似文献
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表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗 CDV中和抗体 相似文献