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1.
《中国家禽》2015,(12)
将受体种蛋分为3组,分别经换壳法、钝端开窗法和赤道面开窗后,比较3种开窗方法对孵化率的影响;分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后用线性化的质粒p EGFP-N1转染鸡ESCs,比较显微注射时3种不同的处理方法对孵化率的影响;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:赤道面开窗法的孵化率显著高于换壳法和钝端开窗法(P0.01);开窗后,显微注射经转染的ESCs组孵化率显著低于其他2组(P0.01);PCR检测结果显示,有四只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中两只鸡的性腺发生EGFP基因的嵌合。表明赤道面开窗后,对受体鸡胚下腔显微注射经转染的ESCs可以生产嵌合体鸡,产生嵌合体鸡的效率为4.17%。 相似文献
2.
为研究异种间嵌合体的制作方法及供体和受体的嵌合情况,同时探讨绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值。本研究利用脂质体介导法将外源pEGFP-N3质粒转入到北京鸭原始生殖细胞(PGCs)中,将转染后的PGCs以微注射法转移至受体北京油鸡的胚下腔,探索转基因鸡鸭嵌合体的制作方法。结果显示:PGCs在转染后6 h开始有外源基因的表达,体外培养24 h后获得了33.6%的转染效率。120枚蛋在整个孵化期中共有33枚鸡胚发育,但最终无孵化成活鸡。在13个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为10.8%。PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,8只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞。研究结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因禽类是可行的。鸭PGCs能够迁移并定居到鸡胚性腺中,并有可能在鸡性腺中增殖分化成有功能的配子。 相似文献
3.
背主动脉注射是生产转基因鸡的经典方法,该方法不需换壳培养,但壳内注射技术难度大,并且无法实时观察后期胚胎发育情况。本实验对背主动脉注射法进行了改进,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)壳外注射至150枚HH 14~16期(Hamburger-Hamilton Stage 14~16)鸡胚背主动脉中,再进行换壳培养,继续孵化至出壳,观察和分析改良背主动脉注射法与传统背主动脉注射法和胚盘下腔注射法对发育8、14、18、21 d鸡胚存活率、孵化率以及EGFP阳性检出率的影响。结果表明:改良背主动脉注射组鸡胚存活率均高于传统背主动脉注射组与胚盘下腔注射组(P<0.05或P<0.01);改良背主动脉注射组的鸡胚孵化率(37%)高于传统背主动脉注射组(16%)与胚盘下腔注射组(28%)(P<0.01);荧光蛋白手电筒检测显示,改良背主动脉注射组鸡胚EGFP阳性率(17%)明显高于传统背主动脉注射组(13%)与胚盘下腔注射组(12%)(P<0.01)。综上,背主动脉壳外注射结合换壳培养提高了转基因鸡胚胎孵化率和EGFP阳性检出率,对提高转基因鸡效率具有重要价值。 相似文献
4.
转移早期囊胚期细胞制备的嵌合体鸡 总被引：1，自引：0，他引：1
用显微注射方法将尼拉商品鸡鸡胚X期细胞液注入同期海兰鸡的囊胚腔中，再经体外培养至出雏，获得尼拉--海兰嵌合体鸡，嵌合体率为5%（3/60），出雏率为15%（9/60）。另一项实验是将受体鸡胚经过600rad^60Co辐射处理后再注入供体细胞并体外培养至出雏，结果嵌合体率为14.0%(8/57），孵化率为15.8%(9/57），其中两只毛色嵌合体公鸡存活至今已经8个月。嵌合体鸡的黑色羽毛可出现在多个部位，有两只鸡的腿部和喙的角质也出现黑色斑。嵌合体鸡血液DNA具有供体鸡的特征带。本研究为进一步制备转基因鸡奠定了基础，也为鸡的发育生物学研究和遗传学研究提供了实验材料。 相似文献
5.
胚盘下腔是禽类胚胎发育到囊胚时出现的特有腔室,通过向禽类胚盘下腔注射外源细胞或基因是常用的制备嵌合体和转基因禽类的方法。本试验通过制备石蜡切片,验证胚盘下腔显微注射效果的方法。以白来航鸡种蛋为模型,向胚盘下腔中微注射少量的标记物,经过琼脂糖包埋脱水后制作石蜡切片,获得完整的鸡胚Ⅹ期胚盘切片。经过HE染色,可以观察到鸡胚Ⅹ期胚盘的上下胚层及胚盘下腔,鉴定标记物是否准确注入胚盘下腔中。结果表明利用本方法可以获取完整胚盘各个切面,准确检验胚盘显微注射效果,为改进显微注射方法和提高转基因禽类制备效率提供新的有利途径。 相似文献
6.
本研究采用小鼠胚胎干细胞(ESCs)裂解液与鸡胚成纤维细胞共孵育,通过形态学观察和多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液逆转化鸡胚成纤维细胞为多能干细胞的可行性。结果表明:与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,形成了42.33个细胞集落;经AKP染色以及Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色,均呈阳性反应,表现出一定的多能干细胞特性;经核型分析表明这些细胞来源于鸡胚成纤维细胞。单独的重编程操作过程和与鸡胚成纤维细胞裂解液共孵育均无法将鸡胚成纤维细胞重编程为具有ESCs特征的细胞,说明参与重编程鸡胚成纤维细胞的物质来源于小鼠ESCs裂解液。因此,ESCs裂解液诱导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的作用能够在小鼠和鸡之间发生。 相似文献
7.
采用显微注射法，分别将人生长激素(hGH)基因和人组织激肽释放酶基因(KLK1)直接注射到孵化24h的鸡胚中，继续孵化。在注射的320枚鸡胚中，孵化前7d死亡194枚，8～18d死亡108枚，孵出雏鸡18只，孵出率为5.6％(18/320)。8只雏鸡分别于出壳后的第1、2、3、5天死亡。7只于3月龄死亡。3只鸡(1公2母)存活至今，并开始产蛋。死亡雏鸡具有脚瘫、体弱、斜颈、站立不稳等异常表现，存活鸡无外观异常，但有产蛋紊乱现象。从孵化4d后死亡的150放鸡胚和18只出壳雏鸡的组织提取基因组DNA，并用DNA杂交试验进行基因整合检测，结果发现其中的3枚鸡胚和3只雏鸡为人生长激素基因整合阳性，基因整合率为12.5％(6/48)；18枚鸡胚和6枚雏鸡为KLK1整合阳性，整合率为22.2％(24/108)。结果表明：鸡胚盘内细胞通过显微注射法可以转染外源基因。 相似文献
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5嵌合体鸡的生产 嵌合体制作最早主要用于发育生物学、细胞遗传学等学科的理论研究。目前，禽类嵌合体的制作中作供体细胞用的囊胚层细胞(BC)和原生殖细胞(PGCs)可以代替受精卵和早期胚胎用于体外遗传操作，已成为禽类转基因研究的一个热点。同时，BC和PGCs还可以在体外进行培养和冷冻保存。基本原理是经过遗传操作的BC细胞或PGCs细胞作供体，嵌合到受体胚胎中。如果是嵌合在生殖细胞，则该嵌合体性成熟后可产生一定比例经过遗传操作的配子。 有关鸡嵌合体方面的报道及鸡嵌合体制作方法、嵌合体的嵌合程度的判断以及怎样提高嵌… 相似文献
9.
通过PCR方法从pSEAP2-control质粒获得人胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)基因,并克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)卵清蛋白基因调控区下游.pSEAP2-contro1和pAB-Sig-AP-SV40质粒转染鸡胚细胞和乳腺癌细胞(MCF-7),转染48h后以对硝基苯磷酸钠(pNPP)为底物检测PLAP的活性,结果pSEAP2-contro1在鸡胚细胞和MCF-7细胞中表达PLAP,pAB-Sig-AP-SV40在鸡胚细胞中不表达,而在MCF-7细胞中表达.说明鸡胚细胞可以表达有活性的人源糖蛋白,另外也说明在雌激素受体细胞中,鸡卵清蛋白基因启动子可启动外源基因表达. 相似文献
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以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。 相似文献
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应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pEGFP-C1转染到培养至第二代的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,同时使用活体DNA染料Hoechst3334(2H342)对CEF细胞核荧光染色,通过荧光倒置显微镜和RT-PCR方法检测GFP的表达产物。在荧光倒置显微镜下可见CEF的胞质和核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质,在H342作用下,细胞核呈现蓝色荧光;转染细胞中转录产物经RT-PCR扩增后,在凝胶上可见与GFP基因片段分子量大小一致的条带。可见,GFP基因可以被转染至CEF中,并在CEF中表达。 相似文献
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为构建鸡维甲酸相关孤核受体α（retinoid acid receptor related orphan receptor α,RORα）的真核表达载体,并检测其在MSB1细胞中的表达效果,本研究参照GenBank中鸡RORα基因序列（登录号：NM_001289887.1）设计特异性引物,从鸡肝脏组织中提取总RNA,经反转录合成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,将扩增的特异性RORα基因片段连接pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-RORα,再用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切克隆载体pMD18-T-RORα和真核表达载体pEGFP-N1,将酶切回收的RORα与pEGFP-N1片段进行连接,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-RORα,经PCR、酶切和测序验证准确性后,将其转染MSB1细胞,于转染后48 h荧光显微镜下观察EGFP的表达情况,并采用实时荧光定量PCR检测鸡RORα在MSB1细胞中的表达水平。结果显示,从构建的重组质粒pEGFP-N1-RORα中可扩增出大小约1 600 bp的特异性片段,用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ可切出大小约4 700和1 600 bp的两条带。实时荧光定量PCR结果显示,转染MSB1细胞48 h后,与对照组相比,重组真核表达载体转染组中鸡RORα基因mRNA水平显著增加（P<0.05）。表明本试验成功构建了鸡RORα的真核表达载体,该载体可在MSB1细胞中表达鸡RORα,为进一步研究鸡RORα对MSB1细胞增殖的影响奠定基础。 相似文献
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以RT-PCR方法对河南省洛阳地区2000-2002年分别从IBD发病蛋鸡和乌鸡鸡群中分离到的5株和4株IB-DV进行了VP2高变区基因的扩增、克隆和测序。核苷酸和氨基酸序列分析发现，9株IBDV中有4处氨基酸发生了变化，即320位的Gln／His。349位的Val／Ile．375住的Pro／Ser和381位的Lys／Arg。这些氨基酸的变化，不符合变异株的特征。核苷酸序列变化主要表现在同义密码子的置换。分别将分离于蛋鸡和乌鸡的各3个毒株交叉感染乌鸡和蛋鸡鸡胚，盲传7代后取尿囊腔绒毛膜分离病毒进行VP2基因的序列分析。结果表明，IBDV VP2基因高变区某些氨基酸同义密码子在蛋鸡和乌鸡细胞中的选择上有偏嗜性。主要表现在第1亲水区220位的Tyr（TAC／TAT）；224、360、393住的Gly（GGA／GGG）；260及420位的Thr（ACC／ACT。ACA／ACT）；271住的Val（GTA／GTG）；279位的Asp（GAc／GAT）；305位的Ile（ATC／ATA）及328位的Ser（TCA／TCG）。病毒在不同品种宿主中对同义密码子使用的偏嗜性，可能是导致蛋鸡和乌鸡对IBDV易感性不同的一个重要原因，也可能是病毒变异及新毒株产生的一条重要途径。 相似文献
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为明确鸡胚肠上皮细胞中Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)的表达情况,本研究采用嗜热菌蛋白酶分离培养18日龄鸡胚的肠上皮细胞,在形态学观察及免疫细胞化学法鉴定基础上,采用RT-PCR方法检测其TLR表达谱,并对不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱进行了比较研究。结果表明,应用嗜热菌蛋白酶消化法得到的鸡胚肠上皮细胞生长状况良好;采用低速离心和差速贴壁进行纯化,得到90%以上纯度的鸡胚肠上皮细胞;纯化后的细胞经形态学观察及细胞角蛋白单克隆抗体鉴定为阳性;10种TLR在鸡胚肠上皮细胞上均有mRNA表达,但其丰度存在明显差异;不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱均无显著差异。 相似文献
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试验旨在研究FOXL2基因对鸡胚性腺分化的影响。本试验分为试验1组、试验2组和空白对照组（鸡胚数量分别为260、100、20枚），试验组通过胚盘下腔注射的方法分别将pLV-FOXL2慢病毒重组质粒、pLV空质粒注入胚胎期第2天的鸡胚，空白对照组不做处理并与试验组一起孵化至出雏，利用CHD1基因遗传性别鉴定的方法对出雏的雏鸡进行性别检测，分析其性腺解剖学、组织学结构变化，并利用免疫组化的方法检测性腺FOXL2和CYP19A1蛋白表达量。结果显示，试验1组遗传性别为公的23只，遗传性别为母的18只，表型性别为公的21只，表型性别为母的18只，其中有2只表型性别不典型，左侧性腺发生变化，朝卵巢结构转变；试验2组遗传性别为公的9只，遗传性别为母的12只，表型性别与遗传性别一致。阳性PCR检测结果显示，试验1组获得阳性个体10个，阳性率为24.4%（10/41）；试验2组获得阳性个体8个，阳性率为38.1%（8/21）。性腺解剖学结果显示，阳性pLV-FOXL2雄性鸡胚左侧性腺体积明显大于右侧性腺，表现膨松状态；组织切片结果显示，雄性鸡胚性腺具有典型的卵巢皮质层和髓质层结构；阳性pLV-FOXL2雌性鸡胚性腺的发育无明显变化。免疫组化结果显示，FOXL2和CYP19A1蛋白在试验1组左右侧睾丸中的表达量与空白对照组母鸡卵巢中的表达量相似，显著高于试验2组（P<0.05）。以上结果表明，FOXL2基因可能促进鸡雄性性腺的性反转，在鸡性腺分化和发育过程中发挥着重要的作用。 相似文献
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The aim of this study was to investigate the effect of FOXL2 gene on gonadal differentiation in chicken embryos.This test was divided into the experiment groups 1,2 and blank control group(chicken embryos were 260,100 and 20,respectively).In the experimental group,pLV-FOXL2 lentivirus recombinant plasmids and pLV empty plasmids were injected into the chicken embryo on the second day of the embryonic stage by subpaneoidal injection.The blank control group was not treated and incubated with the experimental groups until the chick was hatched.CHD1 gene genetic sex identification method was used to detect the sex of chicks,the changes of gonadal anatomy and histological structure were analyzed,and the expression levels of FOXL2 and CYP19A1 proteins were detected by immunohistochemistry.The results showed that in the experiment group 1,there were 23 male and 18 female of genetic sex,21 male and 18 female of phenotypic sex,and two of them had atypical phenotypic gender,with changes in the left gonadal gland toward ovarian structure.The phenotypic sex was consistent with the genetic sex in experiment group 2,with 9 male and 12 female.Positive PCR results showed that 10 positive individuals were obtained in the experiment group 1,with a positive rate of 24.4% (10/41),and 8 positive individuals were obtained in the experiment group 2,with a positive rate of 38.1% (8/21).The anatomical structure of the gonad showed that the volume of the left gonad was significantly larger than that of the right gonad in the positive plV-FOXL2 male embryos.The results of tissue sections showed that the gonad of male chicken embryo had typical structure of ovarian cortex and medulla.There was no significant change in the development of gonad in female embryos with positive pLV-FOXL2.Immunohistochemical results showed that the expression levels of FOXL2 and CYP19A1 proteins in the left and right testicle of experiment group 1 were similar to that in the hen ovary of the blank control group,and were significantly higher than that in experiment group 2 (P<0.05).These results suggested that FOXL2 gene might promote the sexual inversion of chicken gonads and played an important role in the differentiation and development of chicken gonads. 相似文献