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新疆加工番茄溃疡病的发生及其病原菌研究 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]番茄溃疡病是番茄上最严重、最具毁灭性的病害之一,2010年6～8月在新疆石河子、奎屯等地的加工番茄田问相继发现典型症状的病株和病果.旨在明确引起该病害的主要病原菌种类,为进一步的防治研究打好基础.[方法]对采集的病株、病果进行病原菌的分离纯化,应用注射法、剪叶法及喷雾接种测定菌株的致病性;通过供试菌株的形态学特征、培养特性、生理生化反应的测定、16S rDNA序列分析及番茄溃疡病菌特异性引物的PCR检测确定病原的归属.[结果]所有供试菌株对供试番茄都具有致病性,表现为茎秆爆裂,植株萎蔫死亡.菌株形态特征、培养特性及生理生化反应都与密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganense subsp.michiganense)的特征相一致;供试菌株16S rDNA核苷酸序列与德国已报道的密执安棒形杆菌密执安亚种菌株的核苷酸序列同源性为99.86;;特异性引物检测也得到预期目标片段.[结论]因此,将此病害确定为番茄溃疡病,其病原为密执安棒形杆菌密执安亚种(C.michiganensis subsp.Michiganensis). 相似文献
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番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测方法研究 总被引：2，自引：0，他引：2
根据番茄溃疡病菌ITS(16S~23SrDNA间隔区)基因序列,设计并合成了荧光PCR检测引物(Fan1和Fan2)及特异性检测探针(Fanprobe),对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株实时荧光PCR反应。结果表明,番茄溃疡病菌PCR产物出现强烈的特异杂交信号,而非番茄溃疡病菌均未出现特异荧光信号,证明这对引物及探针具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将番茄溃疡病菌DNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系可检出52.3 fg/μL的模板。 相似文献
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番茄溃疡病一步法快速检测技术研究 总被引：1，自引：0，他引：1
对番茄细菌性溃疡病菌进行种子带菌的模拟检测试验.对用菌液处理过的种子进行简单抽提和纯化,不经过DNA提取而以抽提和纯化的病原菌为模板直接进行一步法PCR检测,对纯菌液Direct-PCR 最低检出限为2 600个细菌/ml,而Nested-PCR最低检出限可达到13个细菌/ml;对种子提取液,Direct-PCR不能检出,而Nested-PCR最低检出限可达到3×105个细菌/ml.一步法Nested-PCR可在12 h内对番茄种子携带的番茄溃疡病菌进行准确的定性鉴定.并且方法方便快速,成本低,灵敏度高,适用于种子携带番茄溃疡病菌的快速鉴定. 相似文献
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【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,CMM）,一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102）,永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。 相似文献
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从湖北省武汉市郊区草莓种植户的大棚内采集萎蔫的植株,分离致病菌,采用PCR扩增、病原菌形态鉴定、致病性、分子检测等方法检测草莓枯萎病菌。结果表明,形态观察为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),接种草莓后出现典型的草莓枯萎病菌症状;采用真菌的通用引物对ITS1和ITS4进行PCR检测,分离得到的致病菌株均能扩增出分子量为567 bp的特异性条带。结合形态、致病性测定和分子检测,确定分离和鉴定的病原菌为草莓枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp.fragariae Winks et Williams)。 相似文献
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以常规PCR为对照,分析了实时荧光定量PCR(q PCR)检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度,并对接种柑橘溃疡病菌后的冰糖橙样品进行了动态监测。结果显示,q PCR检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度比常规PCR高1~3个数量级,且常规PCR对柑橘溃疡病菌DNA的检测会受到寄主植物DNA的干扰,q PCR不受寄主植物DNA影响;对接种后冰糖橙样品的分析,q PCR即时就能检测到柑橘溃疡病菌,并能实时观察到柑橘溃疡病菌在寄主叶片的增殖情况,而常规PCR要接种后2 d才能检测到柑橘溃疡病菌。 相似文献
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《西南农业学报》2017,(1)
将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m L;当EMA的浓度为2.0μg/m L时,能有效抑制1.0×107CFU/m L灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105CFU内,每个q PCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2=0.987)。不同温度处理后EMA-q PCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存。对疑似带病番茄种子样品进行EMA-q PCR检测,发现EMA-q PCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果。本研究建立的EMA-q PCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。 相似文献
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2009 - 04在河南省中牟县番茄保护地内发现疑似番茄溃疡病病株,对来自发病植株及其根围土壤的20种细菌性分离物进行了生理生化特征、致病性测定及形态学特征分析,初步确定其中出现最频繁的一种分离物J16为番茄溃疡病菌,将其人工接种时能够诱发出溃疡病症状.利用番茄溃疡病菌的16S-23S rDNA ITS序列特异性引物(... 相似文献
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[目的]建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术.[方法]利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)16S-23S序列设计LAMP(loop-mediated isothermal amplification)引物,建立玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系,并对反应条件进行了优化.[结果] LAMP在内引物、环化引物和外引物比为6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25山体系下64℃反应30 min为最佳反应条件,且LAMP引物能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn梯度性条带.以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模板检测LAMP体系的灵敏度,结果显示,LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.6CFU,比普通PCR灵敏度高100倍.[结果]LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好,在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大. 相似文献
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双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。 相似文献
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以SYBR Green I为指示剂,建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增,通过对体系中各成分进行优化,最终确定25μL反应体系中模板200ng,MgSO4的适宜浓度为3.0mmol/L,Bst DNA聚合酶2U,dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L,外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好,在65℃最佳反应时间为40min。在优化的体系条件下,获得的反应产物经SYBR Green I染色后,肉眼观察检测灵敏度可达到50CFU/mL,且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。 相似文献
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以番茄细菌性溃疡病病菌的特异性基因cytC为检测靶标,以番茄溃疡病病菌等8种病原细菌为供试菌株.根据检测靶标设计环介导等温扩增(LAMP)引物并进行特异性和灵敏度检测.结果显示,引物cytC-170能特异性检测出番茄溃疡病病菌,检测灵敏度高达5×105 copy/μL,环引物的加成将试验进程缩短为33.06 min,使整个反应控制在50 min内.研究建立的LAMP检测方法操作简单,结果可视,非常适用于番茄细菌性溃疡病病菌的现场快速检测. 相似文献