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1.
番木瓜果实成熟相关基因的cDNA-AFLP分析及克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
为了探讨番木瓜果实成熟机理,利用cDNA-AFLP技术对破色期和半黄期的番木瓜果实进行基因差异表达分析,获得了50个与果实成熟相关的差异基因片段,其中28个与GenBank数据库中的功能基因同源,分别参与了果实成熟过程中基因表达调控,DNA与蛋白质合成及运输,蛋白质降解,能量代谢,营养物质代谢和逆境胁迫反应等过程。在差异片段序列基础上设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术成功克隆了4条差异基因cDNA全长,分别命名为CpGMP、CpPAA1、CpPOD和CpMYB。半定量RT-PCR分析结果表明,随着果实的成熟衰老,4个基因的表达量相应变化,说明其可能参与果实的成熟过程。 相似文献
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以‘奥林达’夏橙[Citrus sinensis（L.）‘Olinda’]为材料,采用RT-PCR结合RACE技术从果萼离层中分离到1个半胱氨酸蛋白酶类基因,命名为CsCysP（GenBank登录号：KJ093387）。该基因的cDNA全长为1 485 bp,开放阅读框（ORF）为1 083 bp,推测可编码360个氨基酸残基的多肽。其基因组序列与cDNA比对后显示有3个内含子。分析发现,CsCysP属于papain-like（木瓜蛋白酶,C1A）家族的半胱氨酸蛋白酶,与拟南芥、大豆、烟草、杨树等的同源蛋白有73% ~ 83%的相似性。亚细胞定位结果显示CsCysP蛋白定位在细胞壁上。qRT-PCR结果表明CsCysP在老叶、成熟果实果萼离层和花中的表达量明显高于幼苗的根、茎、叶。CsCysP的表达被脱落酸、高盐和PEG6000诱导,低温、乙烯、芸薹素内酯、水杨酸和甲基茉莉酸可抑制其表达。利用基因工程手段获得了柑橘过表达CsCysP的5个转基因株系。 相似文献
3.
香蕉泛素结合酶基因与果实成熟关系的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
根据香蕉果实采后早期成熟的抑制缩减杂交文库获得的香蕉泛素结合酶基因片段,从香蕉（Musa acuminate L. AAA group‘Brazilian’）果实中克隆了泛素结合酶基因的cDNA全长,命名为MaUCE1。该cDNA全长890 bp,编码152个氨基酸。BlastX分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与烟草（BAB40310）、小麦（AAA34310）、拟南芥（L19351）和马铃薯（ABA46759）有较高的一致性（95.39%、95.39%、92.11%和90.79%）,并且结构域分析发现该序列具有泛素结合酶E2的酶活性中心部位和一个与其他真核生物泛素E2酶相同,在泛素E2硫酯键形成中具有催化活性,并在进化上高度保守的半胱氨酸残基。该基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达,但在花和果实中的表达量较高,并且在果实成熟后期表达量升高,与淀粉磷酸化酶活性变化一致,与淀粉含量的变化呈负相关,暗示该基因可能参与香蕉果实成熟过程中的分解代谢,而与果实成熟启动无关。 相似文献
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乙酰水杨酸调控猕猴桃果实后熟软化进程中的Ad-EXP1基因表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以布鲁诺猕猴桃(Actinidia deliciosa cv.Bruno)成熟果实为材料,根据植物α-expansin(EXP)基因的氨基酸保守序列设计简并引物,利用RT-PCR方法结合3’RACE扩增得到1个长为957bp的cDNA片段(Ad-EXP1)。该基因片段编码211个氨基酸,与其它植物该基因核苷酸同源性为59%～85%,氨基酸同源性为73%～91%。Northern杂交结果表明,Ad-EXP1基因在采收当天的果实中表达很弱,随着果实成熟衰老进程加快趋于增强;乙酰水杨酸(ASA)处理延缓果实后熟软化和乙烯生成,也显著抑制Ad-EXP1基因表达。鉴于Ad-EXP1表达丰度与乙烯生成、果实软化程度的一致性,推测该基因在猕猴桃果实后熟软化进程中起着重要作用。 相似文献
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采用RT-PCR和RACE技术,从刺梨（Rosa roxburghii Tratt）果实中扩增出GDP-L–半乳糖磷酸酶（GDP-L-galactose pyrophosphatase,GGP）基因的全长cDNA序列,并分析其在不同组织和果实不同发育阶段的表达特点及其与AsA积累的关系。结果表明：刺梨GGP基因cDNA（RrGGP,GenBank 登录号：HM998753）包含1个长度为1 341 bp的开放阅读框（ORF）,编码445个氨基酸;其氨基酸序列与苹果、猕猴桃等的相似性均在80%以上。RT-PCR分析表明,该基因在刺梨不同器官中的表达差异明显：在果实中的表达量最强,叶中次之,而花和茎中只能检测到极微弱的表达。在果实不同发育时期都能检测到RrGGP的表达,在发育初期（花后50 d内）表达较弱,花后60 ~ 100 d呈高水平表达,而后随着果实成熟而下调。刺梨中RrGGP的表达特点与AsA积累高度一致,意味着该基因可能是果实发育过程中AsA合成的关键基因。 相似文献
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【目的】克隆一个与番木瓜果实软化相关的扩展蛋白基因,分析其功能,明确其在不同组织器官和不同成熟时期果实的表达模式。【方法】基于对番木瓜果实转录组学的研究,筛选并克隆了一个与果实软化相关的扩展蛋白基因Cp EXPA2。采用同源序列对比和系统进化树分析对该基因进行序列分析;运用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行结构分析;使用RT-q PCR方法分析Cp EXPA2基因在不同组织器官、不同成熟时期果实中的表达量;采用GY-4硬度计测定不同成熟时期番木瓜果实的硬度。【结果】Cp EXPA2基因的开放阅读框(ORF)为780 bp(Gene Bank登录号为MF662209),编码259个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列具有典型的扩展蛋白保守结构:N端富含8个半胱氨酸、C端富含4个色氨酸和中间1个组氨酸功能域(His-Phe-Asp,HFD)。同源序列比对分析发现该扩展蛋白与山木瓜(ABF48653.1)、番茄(AAC64201.1)、草莓(AAF21101.1)、拟南芥(AAB38073.1)等扩展蛋白氨基酸序列有较高的同源性,分别为66.15%、64.86%、66.80%、65.00%。进化树分析表明,Cp EXPA2蛋白与拟南芥At EXPA6(U30480)、At EXPA16(NM_115407)关系最近。Cp EXPA2在不同组织器官中的表达量依次为成熟果实叶花茎根;在不同发育时期的果实中,Cp EXPA2在果皮的表达量相对高于果肉,且随着果实成熟软化程度提高,其表达量也相应提高。番木瓜果实的硬度随着果实的成熟呈逐渐下降趋势,在破色期开始硬度急剧下降,果实迅速软化。【结论】Cp EXPA2基因的扩展蛋白家族高度保守,且该基因编码的蛋白与山木瓜、番茄、草莓、拟南芥等扩展蛋白的氨基酸序列有较高的同源性。系统进化树分析发现番木瓜Cp EXPA2与拟南芥At EXPA6和At EXPA16亲缘关系较近。Cp EXPA2受乙烯诱导,且与果实发育进程有关,因此推测该基因可能在番木瓜果实成熟软化过程中发挥着重要的作用。 相似文献
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在26S泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解过程中,RING finger蛋白是一类特殊的泛素蛋白连接酶,参与植物多个生长发育及逆境胁迫响应过程。为探明柚RING finger家族成员的序列特征及表达模式,从红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实汁胞中分离出两个RING finger基因cDNA片段（CgRHF1和CgRHF2）,采用实时荧光定量PCR研究其在不同组织及果实发育不同时期的表达模式。结果表明,两个基因均属于RING-H2 finger家族成员,且红肉蜜柚与琯溪蜜柚的两个CgRHF之间碱基序列均无差异;除根组织外,CgRHF1表达水平较CgRHF2高,且在红肉蜜柚茎、叶和花中的表达水平显著高于琯溪蜜柚;CgRHF2在组织及果实发育过程表达水平均较低,但在果实成熟采摘阶段急剧上升。CgRHF1与CgRHF2表达模式的差异暗示这两个基因在柚组织及果实发育进程中行使不同的生物学功能,而非功能互补基因。 相似文献
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《果树学报》2010,(6)
以番木瓜果肉为试材,提取总RNA,反转录为双链cDNA。采用cDNA末端快速扩增方法(RACE),获得了番木瓜果肉Actin基因的全长cDNA序列,将其命名为CpActin,Genbank登录号为FJ696416。CpActin全长cDNA为1533bp,含有一个1134bp的开放阅读框,编码377个氨基酸,与毛白杨、葡萄、水稻、拟南芥的Actin同源性分别为98.94%、98.67%、96.29%、94.69%。利用邻接法构建了部分高等植物、哺乳动物和真菌的Actin系统进化树,结果表明番木瓜与葡萄的Actin进化距离最小。采用半定量RT-PCR技术分析CpActin基因在不同成熟度番木瓜果实中的表达情况,发现该基因的表达水平没有明显差异,表明CpActin基因可以作为内参,进行番木瓜其他果实基因差异表达的研究。 相似文献
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为了探讨草莓中单脱氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbate reductase,MDHAR）和谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GR）基因的功能,采用同源克隆的方法从‘丰香’草莓中克隆得到cDNA全长序列,并采用实时定量PCR方法对其在不同组织和不同发育阶段果实中的表达模式进行分析。结果表明：草莓MDHAR基因cDNA（FaMDHAR,GenBank登录号：KP025946）全长1 305 bp,编码434个氨基酸,分子量约为47 kD,含有保守的FAD结合结构域,定位于细胞质中。GR基因cDNA（FaGR,GenBank登录号：JQ339738）开放阅读框全长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为53 kD,定位于细胞质中。FaMDHAR在各组织中均有表达,在成熟果实中表达量最高,叶和花次之,根中最低;在果实发育过程中FaMDHAR在绿果期有相对较高的表达,随后急剧增加,到白熟期最高,之后下降并维持在相对稳定水平。FaGR在叶和花中表达较高,在成熟果实中较低;在果实发育过程中,表达量从小绿期呈现增加趋势,至转红果期达最高,随后逐渐下降,在成熟果实中较低。果实发育过程中酶活性变化呈现出与各自基因表达量相似的变化规律。经过4 ℃低温处理24 h后的草莓叶片中,FaMDHAR相对表达量较对照显著增加,而FaGR无显著变化。草莓中FaMDHAR和FaGR表达存在时空差异,并对低温逆境响应存在差异。 相似文献
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以番木瓜（Carica papaya L.）花为材料,利用番木瓜基因组序列设计番木瓜CpFT1和启动子扩增引物,通过PCR获得了该基因长度为525 bp的基因组DNA序列和1 500 bp的上游调控序列。通过生物信息学分析,发现CpFT1编码174个氨基酸。经序列对比及进化分析发现,番木瓜FT基因与山毛榉FT基因同源性最高。亚细胞定位显示CpFT1蛋白定位于细胞核。进一步分析CpFT1的启动子序列,脱落酸、赤霉素、水杨酸等激素调控相关的元件位于CpFT1上游1 500 bp的序列上。利用实时荧光定量PCR检测了CpFT1在不同性别花器官、花不同发育阶段以及不同激素处理下花中的表达差异,结果表明CpFT1的表达可能受到脱落酸、水杨酸等激素的调控。 相似文献
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藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析 总被引：4，自引：0，他引：4
以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。 相似文献
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以‘妃子笑’荔枝（Litchi chinenesis）为试材,通过PCR方法克隆了荔枝类甜蛋白基因LcTLP（登录号JF682821）的cDNA全长和完整开放阅读框（ORF）对应的gDNA序列。序列分析表明：该基因无内含子,cDNA序列含有一个672 bp的ORF,编码223个氨基酸残基序列。荧光定量PCR结果表明：LcTLP在花中表达量最高,其次是果皮,在果肉中表达量最低;在果实发育过程中,果皮中LcTLP表达量先上升后下降,采后果皮中的表达量高于采前,炭疽菌侵染诱导LcTLP的表达,失水和低温能抑制LcTLP的表达。 相似文献
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以红穗醋栗（Ribes rubrum L.）和白穗醋栗（R. albrum L.）果实为试材,采用RACE方法克隆黄烷酮3–羟化酶（F3H）基因cDNA全长序列,分别命名为RrF3H和RaF3H（KU984435和KU984436）。RrF3H全长1 351 bp,开放阅读框长1 098 bp,编码365个氨基酸;RaF3H全长1 291 bp,开放阅读框长1 098 bp,编码365个氨基酸。氨基酸多序列比对表明该基因编码的蛋白具有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶结构域）,属于双加氧酶超家族。系统发育分析表明,RrF3H和RaF3H在进化上具有明显种属特性,属于相对独立的进化分支。定量PCR分析表明,F3H在红穗醋栗中表达量远远高于白穗醋栗,在红穗醋栗中随着果实着色加深表达量逐渐上升,果实着色约75%时表达量最高,之后下降;白穗醋栗中随着果实生长,该基因的表达下降,花色苷含量也呈下降趋势,说明F3H基因在醋栗果实着色过程中发挥作用。 相似文献
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为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。 相似文献
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采用RT-PCR法从‘米良1号’猕猴桃中分离到1 066 bp的铜锌超氧化物歧化酶分子伴侣蛋白基因AdCCS1,登录号为KY471361。AdCCS1的开放阅读框为984 bp,编码327个氨基酸,包含3个典型结构域（N端结构域、中间结构域和C端结构域）和2个保守的金属结合位点（MXCXXC和CXC）。基因结构分析显示AdCCS1由6个外显子和5个内含子组成。系统进化分析表明AdCCS1聚在双子叶植物分支中,与茶树CsCCS的亲缘关系最近。此外,AdCCS1的5′端调控区存在多种光响应、胁迫响应和激素响应应答元件。定量PCR分析显示,AdCCS1在猕猴桃叶片中的表达量最高,其次是成熟果、花、幼果和茎,在根中的表达量最低。猕猴桃果实中AdCCS1在4 ℃低温贮藏过程中的表达量均比25 ℃贮藏中同期的低,说明低温抑制AdCCS1的表达。脱落酸和赤霉素处理后AdCCS1的表达下调,但二者的应答模式不同。 相似文献
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从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA（GenBank登录号：JF412788）,该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸（ABA 50 μmol · L-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L-1）5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG 和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。 相似文献
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根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的Rab11 片段,采用RT-PCR结合RACE 技术,从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个Rab11 完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA 全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218 个氨基酸。同源性分析表明MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d 的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。 相似文献
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月季CBF 转录因子基因的克隆及表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据CBF（C-repeat binding factor）AP2/EREBP 保守区设计1 对简并引物,采用PCR 方法对月季‘寒锦4 号’（Rosa hybrida‘Hanjin 4’）CBF 转录因子基因中间片段进行克隆;再根据中间片段区域设计了两对特异引物,采用反向PCR 方法对该基因的5'和3'端的序列进行克隆,将中间片段与反向PCR 产物拼接得到CBF 基因全长序列,命名为RhCBF,GenBank 注册编号为EF582843;该基因序列长758 bp,ORF 为603 bp,编码200 个氨基酸;同时,根据基因序列设计1 对特异引物,利用荧光定量PCR分析月季CBF 在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示低温和盐均可以诱导RhCBF 的表达,而干旱处理不能诱导其表达。 相似文献
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辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备 总被引：4，自引：1，他引：3
采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。 相似文献