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1.
泉古菌Sulfolobus islandicus PCNA1的原核表达及其多克隆抗体的制备 总被引：2，自引：2，他引：0
泉古菌Sulfolobus islandicus中PCNA有3个同源类似蛋白,本研究选取PCNA1作为研究对象,为获得可溶性表达的PCNA1蛋白,制备多克隆抗体,深入了解PCNA1基因的功能,将PCNA1基因片段克隆到组氨酸标签融合的表达载体pET30a中,利用IPTG诱导,金属螯合亲和层析进行纯化分析表明,融合蛋白大部分可溶。紫外分光光度法测定纯化蛋白的纯度可达90%以上,浓度约为2 mg/mL。免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价可达1∶10 000以上,Western印迹检测证明抗体特异性良好。 相似文献
2.
蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具. 相似文献
3.
【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。 相似文献
4.
目的: 制备RBBP10多克隆抗体.方法:用纯化的RBBP10蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,stern印迹检测抗体特异性.结果:抗血清效价可达1:1000以上.结论:经Western印迹检测证明抗体效价高,特异性强,此抗体可通过免疫组化方法检测RBBP10蛋白在各种肿瘤中的表达,具有一定的应用价值. 相似文献
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【目的】原核表达斑马鱼（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受体B（PTPRB）并制备多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒,转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达,然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490,属于亲水性蛋白,且具有较丰富的潜在抗原表位位点,分布均匀,无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB,转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达,即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在;以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔,其血清抗体效价为1∶2048000,说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应,获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示,PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化,可获得高纯度的多克隆抗体,纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB,以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具,也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。 相似文献
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【目的】制备香蕉线条病毒广东分离物(BSV-GD)MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清,为BSV基因编码蛋白功能的研究提供条件.【方法】对BSV-GD ORF3基因氨基酸序列进行生物信息学分析,得出MP功能域基因序列,克隆该基因并插入载体pET-28b(+)构建原核表达载体,经IPTG诱导表达后,采用超声波裂解法进行蛋白可溶性分析,利用组氨酸标签纯化试剂盒对目的融合蛋白进行纯化和回收,然后以纯化的目的蛋白为抗原免疫健康家兔制备其多克隆抗血清;通过Western-blot分析该抗血清的特异性,间接ELISA法检测该抗血清的效价.【结果和结论】MP功能域基因在ORF3中的序列为61~311 aa处,核酸序列长753 bp.试验克隆了该基因并成功构建了其原核表达载体pET28b-MP,经IPTG诱导1 h后表达了相对分子质量约为30 800的融合蛋白6His·MP.可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在,纯化获得了高纯度的目的融合蛋白,以其为抗原成功制备了BSV-GD MP功能域基因编码蛋白的多克隆抗血清;分析表明该抗血清具有很强的特异性,其效价高达204 800倍以上. 相似文献
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[目的]禽网状内皮增生症病毒(reticuloendothelial virus,REV)囊膜蛋白与细胞表面受体结合启动病毒感染,并在REV的复制、致病过程中具有重要作用.为探索REV囊膜蛋白相关生物学特性,研究获得了高效表达的禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白,制备多克隆抗体.[方法]利用原核表达载体pET-28a和pGEX-6p-1表达REV囊膜蛋白gp90,并通过Ni2+亲和层析柱对融合蛋白REV-His-gp90进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了多克隆抗体;纯化的REV-GST-gp90蛋白用于检测多克隆抗体效价.[结果]pET-28a-REV-gp90和pGEX-6p-1-REV-gp90表达质粒构建成功,通过SDS-PAGE验证蛋白能在大肠杆菌BL21菌株中表达;Western-blot检测结果显示制备的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性;采用间接ELISA法检测抗血清效价为1:64000;IFA结果显示,制备的多克隆血清能与REV特异性反应.[结论]研究制备的多克隆抗体效价高、特异性良好,为进一步开展REV囊膜蛋白的生物学特性研究及其特异性抗体应用奠定基础. 相似文献
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应用PCR方法克隆了创伤弧菌Vibrio vulnificus FJ03-X2株的铁调基因fur(Ferric uptake regulator),该基因片段大小为450bp,编码149个氨基酸;以pET32a为表达载体,构建了原核表达质粒pET32a-FUR,表达质粒测序结果表明目的基因与GenBank中报道的创伤弧菌fur基因的同源性达98%以上;诱导表达获得可溶性的重组表达蛋白rFUR。镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化rFUR,SDS-PAGE电泳分析其分子量约33kD。以纯化后的融合蛋白rFUR为抗原,4次免疫SD大鼠,制备抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗体。用ELISA方法检测鼠多克隆抗体的效价达到1∶256 000,表明融合蛋白rFUR具有良好的免疫原性。 相似文献
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【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。 相似文献
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【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。 相似文献
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Trans-activator gene of HTLV-II induces IL-2 receptor and IL-2 cellular gene expression 总被引：20，自引：0，他引：20
W C Greene W J Leonard Y Wano P B Svetlik N J Peffer J G Sodroski C A Rosen W C Goh W A Haseltine 《Science (New York, N.Y.)》1986,232(4752):877-880
The human T-lymphotropic viruses types I and II (HTLV-I and -II) have been etiologically linked with certain T-cell leukemias and lymphomas that characteristically display membrane receptors for interleukin-2. The relation of these viruses to this growth factor receptor has remained unexplained. It is demonstrated here that introduction of the trans-activator (tat) gene of HTLV-II into the Jurkat T-lymphoid cell line results in the induction of both interleukin-2 receptor and interleukin-2 gene expression. The coexpression of these cellular genes may play a role in the altering T-cell growth following retroviral infection. 相似文献
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目的:探讨血清IL-2、IL-6、IL-18水平与丙型肝炎病变的关系。方法:运用EL ISA法检测不同类型丙型肝炎感染者血清3种细胞因子IL-2、IL-6、IL-18的水平,观察感染者细胞因子水平与肝炎发展的关系。结果:慢性及重症肝炎感染者血清IL-2水平出现显著性下调(P<0.05),而慢性及重症肝炎感染者的IL-6、IL-18的水平均显著高于正常对照组(P<0.05或P<0.01),升高程度与病情相关。结论:血中细胞因子水平是判断丙肝感染者免疫状态及进行治疗的重要指标。 相似文献
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雏鸡经马立克氏病（ＭＤ）三价疫苗免疫后，脾脏和胸腺Ｔ淋巴细胞白细胞介素２（ＩＬ－２）诱导活性比未免疫健康对照雏鸡和火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）疫苗免疫雏鸡显著升高（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５），白细胞介素２受体（ＩＬ－２Ｒ）诱导表达显著增加（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．０１Ｐ＜０．０１）；雏鸡经ＨＶＴ疫苗免疫后，脾脏Ｔ淋巴细胞ＩＬ－２Ｒ诱导表达比未免疫健康对照雏鸡显著增加（Ｐ＜０．０５），脾脏和胸腺Ｔ淋巴细胞ＩＬ－２诱导活性和胸腺丁淋巴细胞ＩＬ－２Ｒ诱导表达虽见升高和增加，但无统计学显著性差异（Ｐ＞０．０５）。 相似文献
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目的：探讨血清IL-2，IL-12、IL-8水平与乙型肝炎病变的关系。方法：运用ELISA法检测不同类型乙型肝炎患者血清IL-2、IL-12、IL-18的水平，观察患者细胞因子水平与肝炎发展的关系。结果：慢性及重型肝炎患者血清IL-2水平出现显著性下调（P〈0．01），而急性、慢性及重型肝炎患者的IL-12、IL-18的水平均显著高于正常对照组（P〈0．01），升高程度与病情相关。结论：血中细胞因子水平是判断乙肝患者免疫状态及进行治疗的重要指标。 相似文献
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为了进一步证实IL-2的存在,我们对IL-2真核表达载体进行了pC-IL-2双酶切鉴定。采用DEAE-Dextran介导的方法,用IL-2真核表达载体pC-IL-2转染COS细胞进行暂态表达。经放射免疫测定了转染细胞上清中IL-2表达量为46.05ng/m l。采用依赖IL-2的CTLL-2细胞作为靶细胞的MTT法测定了IL-2表达产物的活性为86 IU/m l。 相似文献
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PCV2对仔猪胸腺IL-2、IL-6和IL-10及其受体mRNA的影响及NO-NOS系统的调控 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirusⅡ,PCV2)引起仔猪免疫抑制的机制,研究了胸腺中抗感染免疫相关基因的动态表达变化及其调控机制.选取19头PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体阴性的普通断奶仔猪,分为对照组(4头)和试验组(15头),试验组每头仔猪接种PCV2病毒悬液,分别在感染后0、14、21和35 d扑杀采集胸腺.用硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)的含量,用比色法检测总一氧化氮合酶(TNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性,用TQ-PCR方法检测胸腺中IL-2、IL-6、IL-10及其受体mRNA的表达变化.结果显示:感染猪胸腺中TNOS和iNOS的活性在试验期间均显著高于对照猪(P＜0.05),NO含量在感染后14 d极显著升高(P＜0.01),IL-2和IL-6 mRNA的表达在感染后各时间点均低于对照猪,尤其在感染后21 d均极显著降低(P＜0.01);IL-10 mRNA的表达在感染后14 d极显著升高(P＜0.01);IL-6和IL-10与各自受体mRNA的表达变化均呈显著负相关(P＜0.05),NO与iNOS mRNA呈显著正相关(P＜0.05).研究表明:胸腺在感染早期表现出较强且适度的抗PCV2感染的免疫应答,感染中期呈现一定的免疫抑制,感染后期有所恢复;胸腺中细胞因子及其受体与NO-NOS系统的相互调节表现出复杂性与多层次性. 相似文献
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目的 观察外周血 4 种细胞因子（IL-2、IL-4、IL-15及IL-21）在HIV感染者/AIDS患者（HIV/AIDS）和正常人表达水平的区别及其与HIV RNA病毒载量和CD3+、CD4+细胞数量的相关性,分析其与HIV感染的关系和临床意义。方法 40例未经抗病毒治疗的HIV/AIDS 和31名正常人,采用ELISA法检测外周血4种细胞因子（IL-2、IL-4、IL-15及IL-21）,使用流式细胞计数法检测外周血CD3+、CD4+ T 淋巴细胞数量,实时聚合酶链反应测定血清中HIV RNA水平。结果 未经抗病毒治疗的HIV/AIDS外周血IL-2、IL-15及IL-21水平低于正常人,而IL-4水平高于正常人（P<0.05）。CD3+、CD4+细胞数量和各细胞因子水平显示出一定的相关关系,IL-2和IL-15水平均与HIV-1 RNA载量呈负相关。结论 提示外周血4种细胞因子都可能参与了HIV感染的致病机制,并与HIV RNA病毒载量及CD3+、CD4+细胞数量相关。 相似文献
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根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。 相似文献
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[目的]研究犬IL-2基因的克隆和表达,为开发新型免疫增强剂和基因工程疫苗提供理论支持。[方法]从犬全血中分离出白细胞,经刀豆素刺激培养20 h后,提取总RNA;根据GenBank中犬IL-2基因序列,设计1对引物,进行PCR扩增,并构建原核表达载体pET-28a,将其转化到宿主菌BL21中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析。[结果]RT-PCR扩增出一条约500 bp的条带,与预期结果相符;重组质粒pMD18-T-IL2经双酶切后,产生一个约500 bp基因片段,说明目的基因被成功克隆;表达载体pET-28a-IL2经双酶切和PCR鉴定后,分别产生一个约500 bp目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,分子量约为20 kDa,与预期蛋白大小基本相同。[结论]犬IL-2基因被成功克隆和表达。 相似文献