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【目的】作为昆虫表皮重要的结构物质,表皮蛋白（cuticle protein,CP）在昆虫对农药表皮穿透抗性形成过程中承担重要作用。锈赤扁谷盗（Cryptolestes ferrugineus）磷化氢抗性问题日益突出,论文旨在揭示表皮蛋白基因在该害虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】基于联合国粮农组织（FAO）推荐的生物测定方法解析5个地理种群（张家港、湘阴、淮安、怀化和太仓种群)锈赤扁谷盗磷化氢敏感性差异。首先通过锈赤扁谷盗转录组数据鉴定获得4个表皮蛋白基因,进而构建系统发育树,并对相应氨基酸序列进行分析。利用基因定量技术（RT-qPCR）解析上述4个锈赤扁谷盗表皮蛋白基因时空（不同发育阶段和成虫不同组织）和不同磷化氢抗性水平下的表达模式,以及表皮蛋白基因对磷化氢胁迫响应的表达模式。使用RNAi(RNA interference)技术对特定的表皮蛋白基因（CfRR2-1）进行沉默,并研究CfRR2-1被有效沉默后锈赤扁谷盗磷化氢敏感性变化情况。【结果】磷化氢敏感性测定结果显示,不同地理种群锈赤扁谷盗磷化氢敏感性水平差异显著,药剂抗性倍数（RR）范围为7.2—1 906.8。系统发育... 相似文献
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【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能。【方法】根据Gen Bank登录的相关序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因Tc OctβR3的c DNA序列。利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系。分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(Tc RPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式。运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达Tc OctβR3,进而利用第二信使c AMP含量测定技术分析Tc OctβR3与配体的结合能力。最后,通过体外合成赤拟谷盗Tc OctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能。【结果】序列分析结果表明,赤拟谷盗Tc OctβR3开放阅读框全长1 305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域。基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果表明,Tc OctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,Tc OctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,Tc OctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平。通过HEK293细胞异源表达Tc OctβR3后,c AMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活Tc OctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1。4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉酪胺(TA)章鱼胺多巴胺(DA)。进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射ds RNA能有效抑制Tc OctβR3的表达,沉默效率高达61.5%,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量。【结论】Tc OctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应。明确了Tc OctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据。 相似文献
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【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD50处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和酯酶（EST）的活性变化。利用Illumina HiSeqTM 2500 高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因（DEG）,运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证3个P450基因并分析6个P450基因（CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc）在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数（RR）分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍,为低至中水平抗性。解毒酶活性测定结果表明,2个敏感种群URMQ2、URMQ3以及2个抗性种群YN2、JMS成虫分别经噻虫嗪LD50处理72 h后其P450活性均显著增加,分别为对照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外,URMQ3种群的GST（CDNB和DCNB为底物）及URMQ2、YN2种群的EST活性显著升高,分别为对照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。转录组分析表明,通过合并组装分别获得噻虫嗪敏感和抗性种群样品56 872 051和62 249 136个原始序列数据以及55 903 706和61 082 076个过滤后的序列数据,过滤后的序列长度分别为8.39和9.16 G,碱基错误率均为0.03%。抗性种群中差异表达的P450基因13个,其中2个基因显著上调。3个上调的P450基因CYP4C1、CYP9e2和CYP305a1的qRT-PCR检测结果与转录组测序结果基本一致,qRT-PCR分析还发现CYP9Ya、CYP9Yc、CYP4C1、CYP305a1和CYP9Z25在抗性种群成虫中表达量显著增加,噻虫嗪LD50处理均可引起URMQ2种群4龄幼虫和成虫CYP9Ya、CYP9Yc表达量显著上调。相关性分析发现成虫对噻虫嗪的抗性水平与CYP9Ya表达量呈显著正相关。【结论】CYP9Ya可能在马铃薯甲虫中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,其他基因的作用也不能排除。 相似文献
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飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。 相似文献
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【目的】 通过克隆陆地棉GhWRKY33并研究其抗旱功能,为棉花抗旱机制解析及分子育种奠定基础。【方法】 利用同源克隆的方法从陆地棉中棉所10号中克隆GhWRKY33的开放读码框（open reading frame,ORF）,并进行生物信息学分析,分析该基因的二级结构、亲疏水性,预测磷酸化位点和启动子区域的顺式作用元件,在NCBI中通过BLASTP检索同源性高的蛋白序列进行序列比对并构建系统发育树;构建35S::GhWRKY33-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导注射烟草叶片,观察荧光信号;利用qRT-PCR检测基因的组织表达特异性,以及干旱、ABA、JA、ET处理下的基因表达模式;构建GhWRKY33过表达载体并转化拟南芥,利用20% PEG6000对野生型和T3代转基因拟南芥进行干旱处理,观察处理后野生型和转基因拟南芥的表型,并测定脯氨酸和丙二醛含量等生理生化指标,分析目的基因与干旱响应基因AtP5CS、AtRD29A、AtCOR15A的表达水平。【结果】 从陆地棉品种中棉所10号克隆获得GhWRKY33的ORF全长为1 533 bp,编码一个含510个氨基酸残基的蛋白,含有2个WRKY保守结构域和2个C2H2型锌指结构,属于第Ⅰ类WRKY转录因子家族;二级结构预测其编码的蛋白主要由无规则卷曲构成,含有26个苏氨酸磷酸化位点,推测可能与磷酸化有密切的关系,亲疏水性预测表明该蛋白属于亲水性蛋白;系统发育树分析显示该蛋白与GrWRKY33同源性最高。亚细胞定位将GhWRKY33定位于细胞核。qRT-PCR显示该基因具有明显的组织表达特异性,在棉花顶芽的表达量最高;干旱、ABA、JA、ET处理后,基因的表达量明显上升。干旱胁迫后,与野生型相比,转基因拟南芥的抗旱性水平明显提高,植株萎蔫程度较轻,其脯氨酸含量显著升高,丙二醛含量显著降低,且目的基因与干旱响应基因AtP5CS、AtRD29A、AtCOR15A的表达水平均明显提高,表明PEG诱导了该基因的表达,进而调控了干旱响应基因表达上调,使转基因拟南芥表现出对干旱胁迫的抗性。【结论】 GhWRKY33响应干旱胁迫,过表达后能明显提高转基因拟南芥的抗旱性。 相似文献
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【目的】酚氧化酶（phenoloxidase,PO）是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原（prophenoloxidase,PPO）形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱（Sogatella furcifera）3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的dsRNA作为对照组,通过注射合成的dsSfPPO后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的开放阅读框长度分别为2 079、999、2 070 bp,分别编码692、332、689个氨基酸,预测蛋白分子量分别为79.84、37.67、79.53 kD,等电点分别为6.43、9.56、6.20。生物信息学分析表明,白背飞虱的3个PPO蛋白具有较高的同源性,且与褐飞虱（Nilaparvata lugens）的亲缘关系最近;SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2均在成虫第3天表达量最高,其中SfPPO2-1和SfPPO2-2的发育表达模式相似;SfPPO1和SfPPO2-1在表皮和脂肪体内表达量较高,而SfPPO2-2在翅和脂肪体内表达量较高,在头、足、中肠、马氏管中表达量相对较低;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后都能够显著沉默目的基因的表达,而且当SfPPO2-1表达被沉默后,SfPPO1出现显著高表达,说明不同的PPO之间可能具有补偿功能;大肠杆菌诱导后12 h,SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量显著升高,SfPPO1表达量则在诱导24 h后显著升高;枯草芽胞杆菌诱导24 h后,SfPPO1、SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量均显著升高。【结论】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的表达存在组织和龄期特异性,且在不同菌诱导情况下存在免疫应答差异性。研究结果有助于更加全面、深入地探索白背飞虱酚氧化酶在调控昆虫发育及免疫中的潜在分子机理。 相似文献
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【目的】以十字花科蔬菜害虫小菜蛾（Plutella xylostella）为研究对象,筛选参与小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的主要细胞色素P450解毒基因,为阐明不同抗性水平小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理提供依据。【方法】利用叶片药膜法测定不同小菜蛾种群3龄幼虫对氯虫苯甲酰的抗性水平,通过转录组测序、insectbase数据库和小菜蛾基因组数据库筛选得到52个细胞色素P450基因。应用MEGA5.10软件对52个细胞色素P450基因进行进化分析,获得与抗药性密切相关的CYP3和CYP4家族P450基因。利用实时荧光定量PCR方法分析目的基因在小菜蛾室内筛选种群（HZY）和田间抗性种群惠州种群（HZ）、连州种群（LZ）、东升种群（DS）、钟落潭种群（ZLT）中的表达量,选用RNA干扰技术,采用注射法,验证在抗性种群中显著上调表达的CYP6BF1V4在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的功能。【结果】抗药性测定结果表明,LZ和HZ小菜蛾种群为中等水平抗性,ZLT、DS和HZY小菜蛾种群为高水平抗性。对52个细胞色素P450基因的系统发育树分析发现,小菜蛾拥有10个CYP4家族基因,28个CYP3家族基因,其中2个CYP4家族基因在HZ和HZY种群中的表达量显著高于敏感种群,4个CYP3家族基因表达量与小菜蛾抗性呈正相关,8个基因在中等水平抗性小菜蛾体内的表达量高于在高水平抗性小菜蛾体内的表达量。对田间种群进一步筛选得到6个与小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺密切相关,在不同抗性种群中均上调表达的细胞色素P450基因,其中4个为CYP6家族基因（CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1和CYP6B6）,2个为CYP9家族基因（CYP9G2.1和CYP9G2.2）,以CYP6BF1V4的表达量最高,其在抗性种群中的表达量是在敏感种群中表达量的3.5—6.3倍。RNA干扰结果显示,沉默CYP6BF1V4能够显著提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性。【结论】CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1、CYP6B6、CYP9G2.1和CYP9G2.2可能在小菜蛾体内协同调控多功能氧化酶的表达,从而加快小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的速度,提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。 相似文献
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【背景】线粒体是生物体内一种重要细胞器，是细胞消耗氧和产生能量物质三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，在生物体抵抗逆境过程中发挥重要作用。锈赤扁谷盗(Cryptolestes ferrugineus)是一种世界性储粮害虫，具有极强的环境适应性。【目的】分析锈赤扁谷盗呼吸速率及线粒体编码基因对不同环境胁迫的响应，探究线粒体在锈赤扁谷盗抗逆境胁迫中的应激反应。【方法】根据锈赤扁谷盗线粒体基因组数据鉴定获得线粒体编码基因，并设计相应实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物。通过生物测定方法得出锈赤扁谷盗对熏蒸剂(甲酸乙酯)、植物源杀虫剂(鱼藤酮)和储粮保护剂(阿维菌素)的毒力回归方程及LC30，并用该浓度对试虫进行后续药剂胁迫处理。利用RT-qPCR技术解析锈赤扁谷盗线粒体编码基因的时空(不同发育阶段和幼虫不同组织)表达模式。最后，使用CO2检测仪和RT-qPCR技术研究锈赤扁谷盗在高温(35和40℃)、甲酸乙酯、鱼藤酮、阿维菌素、饥饿等逆境胁迫下呼吸速率的变化以及线粒体编码基因的表达模式。【结果】共设计12个线粒体编码基因(除nad6)的定量引物。RT-qPCR结果显示这... 相似文献
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【目的】锌指蛋白（zinc finger protein,ZFP）在植物非生物胁迫应答中起重要的作用,研究两个锌指蛋白基因MiZAT10A和MiZAT10B转入拟南芥对盐、干旱、重金属以及外源激素等非生物胁迫的应答,为抗逆育种提供理论依据。【方法】利用在线软件PLACE和MEME分别对芒果MiZAT10A和MiZAT10B进行启动子顺式作用元件以及motif预测和分析,并利用TBtools软件和‘四季蜜芒’基因注释文件（GFF文件,未公开）绘制染色体定位图;通过实时荧光定量分析MiZAT10A和MiZAT10B的组织表达模式;构建芒果MiZAT10A和MiZAT10B超量表达载体,采用农杆菌花序浸染法转化模式植物拟南芥,观察并记录转基因拟南芥开花表型以及在盐、干旱、重金属以及外源激素脱落酸和赤霉素处理下的根生长情况。【结果】启动子顺式元件分析显示,两个基因的启动子区域都有许多光响应元件、激素响应元件和非生物胁迫响应元件。表达模式分析显示,MiZAT10A与MiZAT10B在芽和花中表达水平最高。MiZAT10A和MiZAT10B分别获得了9株和14株转基因拟南芥,开花表型分析显示,Mi... 相似文献
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【目的】以香水柠檬（Citrus limon (L.) Burm. F.）为研究对象,分析两个RHF2A的时空表达规律,利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补试验（BiFC）筛选、验证其互作蛋白,为深入研究RHF2A在香水柠檬自交不亲和过程中的分子作用机制奠定基础。【方法】从前期转录组和泛素修饰组（未公开）筛选获得2个E3泛素连接酶RHF2A(RING-H2 Zinc Finger2A)基因RHF2A-1、RHF2A-2,并克隆其全长序列,通过生物信息学分析2个RHF2A的序列和蛋白质结构,预测其启动子顺式作用元件,构建35S-RHF2A-GFP融合蛋白表达载体用于亚细胞定位分析,采用实时荧光定量PCR分析两个RHF2A的时空表达模式,构建酵母双杂诱饵载体从香水柠檬酵母文库筛选互作蛋白。构建BiFC载体,在洋葱活体细胞内对目标蛋白进行互作验证。【结果】从香水柠檬克隆获得RHF2A-1、RHF2A-2,ORF全长分别为1 161和1 134 bp;NCBI结构域预测发现其具有Ring/U-box结构域。启动子分析发现其具有花粉特异性表达相关元件POLLEN1LELAT52、GTGANTG10... 相似文献
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【目的】淀粉降解与水稻浆片膨大和颖花开放过程密切相关,探究α-淀粉酶基因在颖花开放过程中的作用,为杂交水稻制种效率及产量的提高提供理论依据。【方法】在水稻扬花时,利用稀释碱性品红溶液进行离体穗子吸水试验,观察碱性品红在颖花中残留的组织,通过碘-碘化钾染色法确定11—14期（依据雄蕊发育分期）淀粉粒的分布变化,并通过RT-PCR、RT-qPCR和GUS报告基因检测多个α-淀粉酶基因在此期间的时空表达模式。【结果】水稻颖花开放前,内外稃片通过相互嵌合的钩合槽（marginal tissues of palea,mtp）将浆片和雌雄蕊封闭在内。当颖花开放时,浆片快速膨大,使得内外稃片的钩合点松开。扬花期间,离体穗子在稀释碱性品红溶液中吸水后,碱性品红染料主要残留在内外稃片钩合槽和浆片相连处组织以及花丝中。碘染试验显示,在12期（颖花开放前）,淀粉粒主要分布在雄蕊和内外稃片钩合槽,浆片中也有少量淀粉粒,在13—14期（颖花开放中）,内外稃片钩合槽和浆片中的淀粉粒均降解。RT-PCR分析发现OsRAmy2A和OsRAmy3D的表达量从12期开始上升,至13—14期表达量显著增强,到受精后1 d(... 相似文献
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【背景】近些年兴起的CRISPR-Cas9基因编辑技术在多种植物中实现了高效的基因打靶,为基因功能研究提供了一种高效快速的方法,但一些CRISPR-Cas9载体编辑效率很低。【目的】通过构建一种由RIBOSOMAL PROTEIN S5 A（RPS5A）启动子启动Cas9并带有红色荧光蛋白筛选标记的CRISPR-Cas9载体,提高拟南芥CRISPR-Cas9编辑效率,并利用这套系统对拟南芥木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因TOUCH4（TCH4）进行编辑。【方法】在pKSE401载体的基础上,以从胚胎发育早期就表现出高转录活性的RPS5A启动子替换35S启动子、以DsRed2替换潮霉素抗性基因,构建拟南芥中使用的CRISPR载体pRSE-WH;以AtTCH4为靶基因,使用CRISPR-P 2.0（http://crispr.hzau.edu.cn）设计靶位点,将所设计的靶点序列在拟南芥参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出2个靶位点target 1和target 2。化学合成带有接头的靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pRSE-WH载体连接,构建TCR1和TCR2表达载体,采用农杆菌介导的沾花法侵染野生型拟南芥Col-0,以红色荧光蛋白为标记筛选获得T1代转基因阳性植株。通过靶位点扩增测序法判断T1代转基因植株在预期靶位点是否发生编辑,根据测序结果的峰图对编辑情况进行解码,进一步分析突变类型及基因型。【结果】构建了一个在拟南芥中高效编辑的CRISPR载体pRSE-WH。TCR1和TCR2成功地实现了对TCH4的定点编辑,靶点一的编辑效率为80%,靶点二的编辑效率为100%,总编辑效率为86%。根据测序结果的峰图解码了T1代植株的突变结果,纯合编辑、杂合编辑、双等位编辑均有出现。对不同的编辑类型进行统计发现,59株T1代阳性植株中,无编辑8株,占比13.56%,纯合编辑9株,占比15.25%,双等位编辑40株,占比67.80%,杂合编辑2株,占比3.39%。在T1代发生纯合编辑以及双等位编辑的株系中选择了无红光种子进行繁种,并对T2代植株编辑情况进行测序检测,结果发现T1代中的突变成功遗传到了T2代无Cas9株系中。【结论】pRSE-WH在拟南芥中展现了极高的编辑效率,并且通过对种子进行红色荧光筛选,能够简便地获得无Cas9且稳定遗传的T3代突变体。 相似文献