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1.
【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦OZR,研究其在小麦抗条锈病防御反应及非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆及RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出1个编码OZR的cDNA序列。利用生物信息学对cDNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在小麦与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的诱导表达情况。【结果】获得小麦OZR,命名为TaOZR。其ORF长240 bp,编码79个氨基酸;蛋白序列理论分子量8.67 kD,等电点9.34;具有信号肽和跨膜区,可能为分泌蛋白;与水稻OZR相似性达76%;TaOZR受条锈菌诱导后在亲和互作中差异不显著,在非亲和互作中诱导表达;外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸、茉莉酸均诱导TaOZR的积累并上调表达;低温、干旱、高盐非生物胁迫下TaOZR表达差异不显著。【结论】首次克隆到一个条锈菌诱导的小麦TaOZR,TaOZR可能通过水杨酸、乙烯、脱落酸和茉莉酸信号途径协同参与小麦对条锈菌的早期防御。 相似文献
2.
【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦Hin1,研究其在小麦抗条锈病防御反应以及抗非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆、RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出一个编码HIN1的cDNA序列;通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;利用实时荧光定量PCR分析该基因在小麦不同器官、与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的表达情况。【结果】分离得到小麦Hin1,命名为TaHin1,开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.24kD,等电点8.67,具有信号肽和HIN1结构域,可能为分泌蛋白;与高粱和水稻HIN1同源性达80%;表达分析结果表明,TaHin1在小麦根、茎、叶组织中表达差异不显著,在小麦与条锈菌互作时,仅在非亲和组合中被诱导表达;外源植物激素水杨酸、茉莉酸诱导TaHin1上调表达,脱落酸诱导其下调表达,而乙烯不诱导其表达;高盐、干旱、机械损伤以及低温等非生物胁迫下,TaHin1均上调表达。【结论】首次克隆到一个受条锈菌诱导的小麦TaHin1,可能通过水杨酸、茉莉酸信号途径参与了小麦对条锈菌的防御反应,而脱落酸在防御反应中起负调控作用,该基因在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中也发挥着一定作用。 相似文献
3.
【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因,明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦条锈菌中获得PsSte12基因,利用生物信息学分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征;借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12,该基因序列含有1个全长2 553bp的开放阅读框;基因组DNA序列含有4个内含子,分别位于开放阅读框第281,429,1 512,1 584位,长度分别为73,79,66和68bp。该基因编码蛋白含850个氨基酸,75个正电荷残基和90个负电荷残基。PsSte12与小麦秆锈菌、杨树锈菌、小麦赤霉菌及构巢曲霉菌中同源序列的相似性分别为87.9%,61.53%,24.3%和25.2%;PsSte12在小麦条锈菌侵染后24和36h大量表达,相对表达量分别为对照的61倍和123倍;PsSte12具有转录活性,其N端为转录激活区。【结论】成功克隆了小麦条锈菌STE类型转录因子PsSte12,证实其具有转录活性,在小麦条锈菌侵染早期诱导表达,推测其参与了小麦条锈菌的侵染过程。 相似文献
4.
【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号转导基因相关,其余EST分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。RT-PCR分析结果表明同一基因在叶锈菌侵染后不同时间点的小麦叶片中表达量不一致,且各基因有不同的表达模式。【结论】推测钙转运ATP酶,谷胱甘肽-S-转移酶,蛋白激酶Pti1,NBS-LRR抗病蛋白和分子伴侣DnaJ等参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库可用于了解小麦与叶锈菌非亲和互作过程中的功能基因,为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库奠定基础。 相似文献
5.
应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中首次分离出1个条锈菌诱导的编码C3HC4型锌指蛋白基因的cDNA序列,暂被命名为TaZFP1。TaZFP1包含一个完整的849 bp的开放阅读框,编码282个氨基酸,具有C3HC4保守结构域;小麦TaZFP1氨基酸序列与水稻OsZFP1相似性达89%,与玉米ZmZFP1相似性达81%。TaZFP1在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaZFP1基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合,表明TaZFP1可能参与小麦对条锈菌的防御反应。 相似文献
6.
【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。 相似文献
7.
【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况,从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料,利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序,对其中获得的507条高质量表达序列标签（EST）进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106 pfu•ml-1,扩增文库滴度2×109 pfu•ml-1,重组率97%,插入片段大小为0.4～3 kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析,已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及 加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质量较高,信息丰富,获得的已知功能基因中能量和代谢相关约占40%,抗病与防御相关约占17.1%,这些信息有利于在分子水平上研究小麦与条锈菌互作机制,为进一步克隆小麦与条锈菌互作中的相关重要基因及功能分析奠定基础。 相似文献
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甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。 相似文献
9.
【目的】克隆小麦条锈菌产孢相关基因PsCon1,分析其在病菌不同发育时期的表达水平。【方法】利用RT-PCR和PCR技术克隆PsCon1的cDNA序列和基因组序列,采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域等基本特性,运用实时荧光定量RT-PCR技术分析PsCon1在夏孢子,芽管以及不同侵染时间的表达水平。【结果】PsCon1由3个外显子和2个内含子构成,开放阅读框长为252bp,编码83个氨基酸;编码的蛋白PSCON1不含跨膜区,无信号肽,定位在细胞质,具有2个conidiation-specific protein6保守结构域。PsCon1与小麦秆锈菌核苷酸序列的一致性在外显子区为78%,内含子区为43%,与小麦秆锈菌(Puccinia graminis)的亲缘关系最近,与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和费氏新萨托(Neosartorya fischeri)的亲缘关系次之。PsCon1在小麦条锈菌萌发夏孢子时期基因表达量为新鲜夏孢子中的1.69倍。在亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后6h和24h表达量最高,分别为在新鲜夏孢子中表达量的3.21倍和2.91倍;在接种后24h至168h,基因表达基本呈下调趋势,在接种后168h的表达量最低,仅为夏孢子时期的0.0004倍,在接种后216h和264h,表达量有所增加,表达量约为接种后168h的15倍。在非亲和组合中,PsCon1在小麦条锈菌接种小麦后36h表达量最高,但仅为新鲜夏孢子基因表达量的0.13倍,基因表达总体呈下调趋势。【结论】PsCon1参与了小麦条锈菌对小麦的侵染,可能作为一个致病相关基因影响了条锈菌芽管和吸器的形成,同时促进了条锈菌在侵染过程中的产孢。PsCon1的克隆为进一步研究该基因在小麦与条锈菌互作过程中的功能奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆小麦蒜氨酸酶基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时定量表达检测。【方法】采用电子延伸结合RT-PCR方法,从小麦叶片分离出蒜氨酸酶基因,网络资源分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在不同条件下的表达情况。【结果】克隆到1个小麦蒜氨酸酶基因TaAly1,其开放阅读框全长1 023 bp,编码340个氨基酸,与水稻和玉米蒜氨酸酶基因的同源性为70%,其基因组DNA序列含有3个内含子;TaAly1在小麦幼苗根部几乎不表达,在叶部表达量最高,其次是茎部;植物激素GA、MeJA、SA处理及条锈菌接种和干旱、低温处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。【结论】成功克隆了小麦TaAly1基因的CDs区,该基因可能通过依赖GA、MeJA和SA的信号通路参与小麦与条锈病的互作。 相似文献
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小麦与条锈菌亲和互作的差减文库构建及初步分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离条锈菌侵染小麦过程中的差异表达基因。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌相应毒性小种CY31号为材料,构建条锈菌侵染阶段的SSH-cDNA文库,挑选250个阳性克隆测序并进行生物信息学分析。【结果】聚类后得到149条非冗余EST（unigene）。经Blast X比对和功能分类分析,其中50条unigene（33.6%）未找到同源性匹配,25条（16.8%）与未知功能蛋白同源性较高;其余74条功能已知的unigene中,与初级代谢、能量相关的基因分别有13条和10个,占8.7%和6.7%,感病及防御相关的基因有6个约占4.0%;此外,获得两个与病原菌有较高同源性的基因。随后,进一步利用RT-PCR对6个基因的表达模式进行了分析。【结论】成功构建了小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离出一部分与小麦条锈病发病相关的基因,可用于进一步研究条锈菌侵染过程中特异基因的功能。 相似文献
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茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献
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【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。 相似文献
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苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。 相似文献
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中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA的克隆及原核表达 总被引：3，自引：2，他引：1
【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a（+）/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2（GenBank登录号：DQ449667）的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429 bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7 kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Acer-ASP2极有可能属于GOBP家族。构建的原核表达载体pET/Acer-ASP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为21kD的融合蛋白,融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体沉淀中（约59.7%）,经洗涤和尿素梯度溶解对包涵体进行了纯化,经凝胶光密度扫描分析,约占最终产物的81.2％左右。【结论】克隆、分析和表达了一个新的编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA序列,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础。 相似文献
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异三聚体G蛋白参与小麦抗叶锈病反应的研究 总被引：3，自引：2，他引：1
【目的】研究异三聚体G蛋白是否参与小麦抗叶锈病反应的过程,为更深入地了解小麦抗叶锈病的反应机制奠定基础。【方法】用异三聚体G蛋白的效应剂处理离体培养的小麦叶片后接种叶锈菌观察侵染型的变化。测量经异三聚体G蛋白的效应剂诱导后防卫反应酶活性值,观察变化趋势。另外用半定量RT-PCR方法检测接种毒性菌株和无毒性菌株后异三聚体G蛋白α亚基基因的表达情况。【结果】用激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后明显可以推迟叶片发病,而抑制剂百日咳毒素（PTX）作用不明显。用G蛋白的激活剂（GTPγS、Mastoparan-7）处理后防卫反应酶的活性升高,而用抑制剂百日咳毒素（PTX）处理后24 h再接种无毒性叶锈菌菌株,防卫反应酶的活性却无明显的变化。无毒性叶锈菌菌株可以诱导叶片中G蛋白基因表达量升高,毒性菌株抑制G蛋白基因的表达。【结论】异三聚体G蛋白可能参与了小麦抗叶锈病的反应过程。 相似文献
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小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。 相似文献