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《中国兽医学报》2015,(8):1260-1263
扩增鸡β-防御素-13(Gal-13)成熟肽基因序列,构建酵母重组表达载体pPICZαA-Gal-13,通过SacⅠ限制性内切酶线性化处理后,电击转化毕赤酵母X-33,并对利用甲醇诱导后的重组菌株表达产物进行表达规律分析和抑菌活性研究。结果表明,扩增到的Gal-13成熟肽基因序列为108bp,共编码36个氨基酸;筛选到的重组菌株均为Mut+表型,其诱导表达上清经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳后,发现其在约5 900的位置出现目的条带,抑菌试验发现其对沙门菌(CVCC534)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)具有抑菌活性。 相似文献
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鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性. 相似文献
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根据基因库中鸡β-防御素Gal-6cDNA基因序列设计2对引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从安徽三黄鸡白细胞RNA中扩增了β-防御素Gal-6cDNA基因片段。得到了大小为250bp片段。将扩增产物纯化并克隆到PGEM-T-Easy载体上,转化感受态细胞DH-5α,经筛选获得重组质粒并测序,用P3/P4引物从重组质粒中扩增出成熟肽,大小约150个bp。测序后Blast分析表明,安徽三黄鸡序列与基因库上已发表的序列相差一个碱基,Gal-6多肽共有67个氨基酸组成,分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。 相似文献
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为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM001009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。 相似文献
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鸡β-防御素是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对细菌、真菌乃至某些被膜病毒具有广谱杀伤作用。试验根据已发表的Gal-2基因序列,设计并合成了一对引物。以骨髓中的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pGEM-TEasy载体上,经筛选鉴定获得阳性重组子pGEM-T-Gal-2。再经EcoRI、XbaI双酶切,插入pMAL-c2x质粒构建表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子成功获得pMAL-c2x-Gal-2重组质粒。 相似文献
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目的:构建安徽三黄鸡β-防御素2(gal-2)基因的真核表达栽体,表达gal-2蛋白.方法:提取鸡肺组织中总RNA,应用RT-PCR技术获得鸡β-防御素2(gal-2)全长eDNA基因片段,经PCR获得gal-2的成熟肽基因片段,并将其克隆入真核表达载体pPIC3.5K中,构建重组表达质粒pPIC3.5K-gal-2;经测序鉴定正确后,电转化巴斯德毕赤酵母菌GS115.经甲醇诱导表达gal-2蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:通过电转化方法成功将经酶切线性化的重组表达质粒整合入宿主菌基因组中,并在甲醇诱导的条件下成功表达出了目的蛋白.结论:成功构建了重组真核表达质粒pPIC3.5K-gal-2;并借助巴斯德毕赤酵母细胞表达出了gal-2的蛋白,其分子量大约为4.1 kDa.该研究为下一步应用基因工程和蛋白质工程技术进行gal-2蛋白的规模化生产奠定了基础. 相似文献
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根据GenBank公布的鸡β-防御素Gal-6基因序列设计2对引物，应用反转录-聚合酶链式反应技术，从鸭、鹅不同组织中扩增了β-防御素基因片段，大小为250bp。选取鸭16个组织和鹅的肝脏检测其表达情况，结果表明，除在肾、皮肤、法氏囊外，其他组织均检测为阳性。经筛选获得重组质粒并测序，从重组质粒中扩增出成熟肽，大小约150bp。克隆的多肽由67个氨基酸组成，分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。BLAST分析表明，鸭基因序列与基因库中已公布的序列相差1个碱基，鹅基因序列则完全相同。 相似文献
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本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础. 相似文献
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《中国兽医杂志》2020,(4)
猪β-防御素1(pBD1)是在猪体内广泛分布的一种抗菌肽,在猪的先天免疫系统中发挥重要的作用。本试验为实现pBD1在巴斯德毕赤酵母中的高效表达,根据pBD1基因的成熟肽序列和巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性,设计合成pBD1三倍串联体(3pBD1)基因序列,将合成的目的基因克隆到表达载体pHLI-S1中,构建重组表达载体pHLI-S1-3pBD1,线性化后的pHLI-S1-3pBD1电转化至毕赤酵母宿主菌GS115,PCR鉴定阳性转化子,MM平板和MD平板鉴定Mut表型。将鉴定为阳性的Mut~+型重组酵母菌株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析表达上清液。结果显示,获得的重组酵母菌株为Mut~+表型,经甲醇诱导表达后,表达上清液中含有分子量为22 kDa的目的蛋白。结果表明,获得了能够表达3pBD1的重组巴斯德毕赤酵母。 相似文献
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为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
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家蝇抗菌肽天蚕素基因的定点突变和高效表达质粒的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
运用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)技术从家蝇体内扩增出抗菌肽天蚕素 (cecropin)基因的开放阅读框(ORF) ,与pMD 18T载体重组 ,经限制性酶切片段分析和核苷酸序列分析 ,与GenBank中报道的序列一致。根据此ORF ,重新合成 1对引物 ,并在碳末端进行定点突变 ,加上Asn编码 ,使其末端酰氨化 ,再利用半嵌套式PCR扩增出家蝇cecropin基因的成熟肽 ,与双酶切的酵母表达载体pPICZαA连接 ,经PCR和双酶切鉴定 ,成功构建了分泌型表达质粒。 相似文献
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鸡β-防御素-1基因(Gal-1)在大肠杆菌中的融合表达与纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
内源性抗菌多肽防御素是机体先天性免疫系统的重要组成部分，可帮助机体防御外界病原微生物的入侵。鸡β防御素-1（Gallinaein-1，Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用，具有很好的研究开发价值。本研究利用PCR技术从重组质粒pGEM-TEasy-gal-1中克隆出Gal-1基因成熟肽区，将该基因插入原核表达载体pET-32a（＋）中，构建重组质粒pET-32a（＋）-gal-1，然后用重组质粒转化大肠杆菌BL-21。挑选阳性克隆菌，用浓度为0．5mmol／L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳显示在目标位置约25kD处出现了条带并用Werstern Blot进行了鉴定。表明Gal-1基因在大肠杆菌以融合形式得到了表达。经灰度扫描显示重组蛋白表达量占细菌总蛋白的15．54％。用50％Ni-NTA纯化树脂进行层析纯化，在洗脱液E中出现单一条带。Gal-1多肽在pET-32a（＋）质粒表达体系中成功表达为鸡防御素多肽下一步的研究奠定基础。 相似文献
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羊泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-T Easy 载体上,经PCR 和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析.随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-MPSP-P32,转化大肠埃希菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确. 相似文献
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本研究旨在克隆鸡成熟肽c DNA序列并构建原核和真核表达载体,研究其在大肠杆菌和毕赤酵母中诱导后融合蛋白的表达情况。利用PCR技术从pDM19-T-Gal-13质粒中扩增得到成熟肽c DNA序列,将其亚克隆到p GEX-4T-1和p PICZαA质粒中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZαA-Gal-13,转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X-33,挑取阳性转化子用进行鉴定和诱导表达,(Tricine)SDS-PAGE检测产物的表达情况,以及真核诱导表达上清液对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。结果显示,成功克隆得到的成熟肽序列长为128bp,包含ATG片段和酶切位点与保护碱共20bp,共编码36个氨基酸;构建获得重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZα-A-Gal-13,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21和酵母X-33,进行诱导表达产物经电泳分析后结果显示,Gal-13融合蛋白在大肠杆菌和酵母中得到大量表达,原核表达分子量是31ku并以包涵体的形式存在,真核表达的分子量5.9 ku并分泌到发酵液中;抑菌试验表明,发现真核表达的发酵无菌上清对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。 相似文献
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本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。 相似文献
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采用RT-PCR 方法从三黄鸡肝脏中扩增β-防御素 Gal-6基因的 cDNA 片段,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAL-6,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21进行原核表达。结果表明,成功获得201 bp的鸡β-防御素基因,SDS-PAGE 电泳分析表明,原核表达的重组鸡融合蛋白分子质量约为32 kD。此外,表达的该重组蛋白对金黄色葡萄球菌有较高抗菌活性。 相似文献
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用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术特异性地扩增到丝羽乌骨鸡β-防御素基因Gal-1(Gallinacin-1),Gal-1(a)(Gallinacin-1(a)),Gal-2(Gallinacin-2),Gal-4(Gallinacin-4)～Gal-13(Gallinacin-13)基因共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,并提交到GenBank,丝羽乌骨鸡β-防御素Gal-1,Gal-1(a),Gal-2,Gal-4～Gal-13基因的登录号为:DQ677632￣DQ677644。将丝羽乌骨鸡13种β-防御素Gal-1～Gal-13基因分别与GenBank中收录的防御素基因比对分析,其氨基酸序列的相似性均在95.5%～100%之间。利用DNAStar软件对所获得的13种丝羽乌骨鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果Gal-1、5、12在同一分支上,Gal-1(a)、4、8在同一分支上,Gal-1、2、9在同一分支,Gal-6、7在同一分支,Gal-13独在一分支上。 相似文献
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鸡β-防御素-1cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引：8，自引：3，他引：8
从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA，经过反转录PCR（RT-PCR）扩增出鸡β-防御素-1（Gallinacin-1，Gal-1）cDNA，将扩增产物与pGEM—T Easy载体相连，经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为198bp，与报道的Gal—1cDNA编码区碱基序列完全相同。分析核苷酸序列表明Gal-1与火鸡异嗜性白细胞肽-1（Turkey heterophil peptides，THP-1）具有85．4％同源性。氨基酸序列方面Gal-1与THP-1同源性最高，为72．7％。将Gal-1基因成熟肽片段插入到酵母表达载体pPIZα-C，构建重组表达载体pPICZα-C-gal-1，电转入表达宿主菌X-33，Zeocin抗性筛选重组菌株。挑取阳性菌株经甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4．5ku位置出现预期条带。对其抗菌活性检测发现具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌的活性。反相高效液相色谱表明阳性菌株表达产物与标准品在层析柱中保留时间一致。 相似文献