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1.
《动物医学进展》2020,(4)
旨在建立一种可视化多重荧光RT-LAMP方法用于检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的核酸,并初步应用于小反刍兽疫和蓝舌病临床样品的检测。比对GenBank中小反刍兽疫N基因和蓝舌病NS3基因保守区域,设计2套LAMP引物,在每条内引物FIP的5′端标记荧光基团。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和干扰性,同时应用该方法检测168份临床样品。结果表明,该方法对小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒高度特异,与口蹄疫病毒、鹿流行性出血热病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反刍动物病毒均无交叉反应,检测灵敏度为200 copies/μL,干扰性小,可同时检测两个不同浓度的模板。对168份样品的检测结果显示,小反刍兽疫病毒的感染率为3.6%,蓝舌病病毒的感染率为13.1%,无两种病毒混合感染;与荧光RT-PCR方法相比,此多重荧光RT-LAMP方法敏感性为91.7%～100%,特异性为100%。表明建立的多重荧光RT-LAMP可快速、准确地检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒,具有较好的临床应用价值。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(10)
为制备蓝舌病病毒(BTV)NS3基因标准样品并建立BTV通用型荧光定量RT-PCR检测方法,本研究首先从BTV-1型核酸中扩增完整的NS3基因,经克隆测序后,采用体外转录方法制备其cRNA。使用RNA保存液稀释至含量约10~8拷贝/μL,分装后进行均匀度和稳定性检验,并通过联合定值确定标准样品的量值。结果表明,BTV NS3标准样品的瓶间差异5%,均匀度和稳定性良好;定值结果为(1.032±0.02)×10~8拷贝/μL。此外,使用该BTV标准样品作为模板,通过优化反应体系和条件,建立了BTV通用型荧光定量RT-PCR快速检测方法,并评价其特异性和敏感性。结果显示,该方法能够对目前流行的26个血清型的BTV核酸检测均为阳性,而与其它相关的反刍动物病毒均无交叉反应,特异性良好,且最低可检测到10拷贝/μL病毒核酸。采用建立的BTV荧光定量RT-PCR方法对送检的临床样品进行检测,并与国家标准规定的套式RT-PCR方法进行比较,结果表明两种方法一致性很高,但荧光定量RT-PCR方法操作更为简便,结果准确,更适用于大量临床样品的检测。 相似文献
3.
为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。 相似文献
4.
为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况,2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5~10月,每周采血1次,11~12月,每月采血1次,采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性,至11月,监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2~13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚,收获鸡胚肝脏,用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏,上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后,出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。采用RT-PCR方法,针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物,扩增其相应片段。结果显示,共分离到86份疑似分离物,其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增,均扩增出1156 bp片段,初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验,67份毒株为蓝舌病病毒,与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现,BTV-1株序列与同型Y863(登录号:KC879616)参考毒株的同源性为92%,BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株,分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2017,(17)
为了提高蓝舌病病毒(BTV)的分离效率,2015年在师宗县设置监控点,选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5—10月份每周采血1次,每次每头动物分别采集常规全血、EDTA抗凝血和肝素抗凝血各1份,检测蓝舌病抗体、蓝舌病病毒核酸并进行病毒分离。结果表明:蓝舌病病毒核酸阳性可以持续4~5周,蓝舌病抗体阳性可以持续5~6周。BTV核酸开始转为阳性到核酸转阳后的第1周和第2周采集的肝素抗凝血,或者蓝舌病抗体转阳前1周到蓝舌病抗体转阳和蓝舌病抗体转阳后1周采集的肝素抗凝血BTV分离效果最佳。说明通过蓝舌病抗体检测或蓝舌病病毒核酸检测确定分离蓝舌病病毒最佳分离时间是可行的。 相似文献
9.
《中国兽医学报》2016,(6):912-916
针对新疆蓝舌病流行现状,本试验以蓝舌病血清学检测为阴性的动物建立监控群,于2014年5月至9月每周采集1次血样,血清学检测出现转阳动物后,取其转阳前后2周血样,接种10日龄鸡胚,收获死亡鸡胚肝脏,研磨浸毒后接种C6/36细胞和BHK-21细胞,出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)样本进行PCR鉴定和电镜观察,并用细胞微量中和试验进行血清定型。经RT-PCR扩增蓝舌病血清型群特异VP7片段和NS1片段,鉴定在1 156,272,101bp处有特异性条带。电镜观察到疑似的病毒颗粒,中和试验结果显示该毒株为BTV-1型。上述结果显示,本研究分离到蓝舌病病毒1株,中和试验定型为BTV-1型。 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2017,(10)
本研究旨在建立一种可同时检测8种常见牛传染病病原体(口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、产肠毒大肠杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和小反刍兽疫病毒)的GeXP高通量快速检测方法。将多重PCR技术和毛细管电泳技术有效地结合,根据上述8种病原体的基因保守序列,设计并合成了8对特异性引物,在每对特异性引物的5′端加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。优化反应体系和反应条件,用单一病毒和混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性,用克隆质粒稀释液来测试GeXP方法的灵敏度,检测305份临床样品,进一步验证该方法的可靠性。结果:优化后的GeXP检测体系,可扩增出各病原体对应的特异片段,能在100拷贝·μL~(-1)水平同时并特异地检测出8种牛病病原体核酸。305份临床样品的检测结果与荧光PCR检测结果一致,阳性样品测序结果表明无非特异性扩增的假阳性。结果显示,所建立的GeXP方法具有高通量、特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,具有较高的临床应用价值。 相似文献
11.
为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示：建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达101.70～102.08copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系IV型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量... 相似文献
12.
《云南畜牧兽医》2019,(5)
为进一步了解2018年我国蓝舌病的流行分布情况,对来自重庆、新疆、吉林、湖北、内蒙古、贵州、河北、广西和云南等9个省(市、自治区)93个县(市、区、旗)的5 721份血清样本进行蓝舌病C-ELISA抗体检测,共检测出1 769份蓝舌病抗体阳性血清,抗体阳性率为30.92%(其中:牛血清样品1 827份,共检测出806份蓝舌病抗体阳性血清,抗体阳性率为44.12%;羊血清样品3 894份,共检测出963份蓝舌病抗体阳性血清,抗体阳性率为24.73%)。对检出的1 769份蓝舌病抗体阳性的血清样品进行BTV-8型微量细胞中和试验,结果均为阴性,未检测到BTV-8型抗体。本研究对我国多地的牛羊进行了BTV的血清学调查,覆盖我国不同气候类型地区,样本量较大,较好的反映了2018年度蓝舌病在中国的分布情况,为该病的防控提供了流行病学依据。 相似文献
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蓝舌病病毒群特异性RT-LAMP检测方法的建立与初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法。根据我国分离BTV毒株Seg-5基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化反应条件及反应体系,进行特异性及灵敏度验证,建立BTV RT-LAMP检测方法;对46株中国分离的12种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24）代表毒株进行检测,进一步对120份BTV核酸阳性血液样品及60份2020年采集自监控动物的临床血液样品进行BTV的RT-LAMP及qRT-PCR检测,验证建立的RT-LAMP检测方法的准确性和可靠性。试验结果表明,本研究建立的RT-LAMP方法最佳反应条件为64℃,扩增45 min;反应体系中外引物：内引物：环引物的最佳浓度及比例为0.2 μmol·L-1：0.6 μmol·L-1：0.4 μmol·L-1。该方法可特异性检测中国流行的12种血清型BTV核酸,与动物流行性出血病病毒（EHDV）、中山病毒（CHUV）、阿卡斑病毒（AKAV）、口蹄疫病毒（FMDV）及非洲马瘟病毒（AHSV）核酸均无交叉扩增现象;最低可检测4.5拷贝·μL-1的BTV核酸。对46株分属12种血清型的BTV代表毒株的检测结果均为阳性;120份BTV核酸阳性血液样品的检测结果与qRT-PCR检测结果无显著差别（McNemar检验P>0.05）,符合率为95.0%;60份临床血液样品的检测结果与qRT-PCR结果完全一致,以上结果表明本研究建立的RT-LAMP方法准确可靠,对中国分离的BTV毒株及临床血液样品均具有良好的检测效果。本研究建立的BTV RT-LAMP检测方法具有反应快速、结果可视化、特异性强和敏感度高等优点,为我国开展BTV检测诊断与流行病学研究提供了技术支持,具有较好的应用前景。 相似文献
14.
蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在分离流行于我国云南省的蓝舌病病毒(BTV),掌握分离BTV的遗传特征与感染特性。采用"鸡胚—C6/36细胞—BHK-21细胞"接种的方式,采集哨兵牛的BTV阳性血液进行病毒分离;采用血清中和试验以及Segment 2与Segment 6ORF区的克隆测序确定分离病毒的血清型;通过病毒噬斑形成和增殖曲线的测定,分析病毒在BHK-21细胞的增殖特性;通过qRT-PCR与血清中和试验分析BTV感染动物血液中病毒含量与中和抗体动态变化情况。结果显示:2013年8月,在云南芒市设定的哨兵牛中分离出一株BTV(毒株号V013/YN/2013),血清中和试验显示V013/YN/2013为BTV-9型病毒,Segment 2与Segment 6序列分析表明分离的病毒属BTV-9Eastern型,与日本毒株和澳大利亚BTV-9型毒株具有最近的亲缘关系。病毒噬斑与增殖曲线测定结果显示V013/YN/2013在BHK-21细胞上增殖能力明显强于BTV-9型参考毒株。自然感染V013/YN/2013的牛在连续5个月的监控期内未出现临床症状,感染动物虽产生了特异性中和抗体,但血液中始终能持续检测到病毒核酸。本研究首次报道了BTV-9Eastern型毒株V013/YN/2013在我国的分离,为进一步开展中国BTV-9型病毒的全基因组测序、诊断方法的建立、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。 相似文献
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帕利亚姆血清群病毒(PALV)在我国广泛流行,给我国牛羊养殖业健康发展构成了严重威胁,目前国内尚无PALV核酸检测方法的报道。本研究根据流行于我国的中山病毒(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)和D’Aguilar virus(DAV)3种血清型PALV的Seg-7保守基因序列,设计针对PALV的群特异性RT-PCR扩增引物,通过反应条件优化,建立了PALV的一步法RT-PCR检测方法,其最佳引物浓度为0.8μmol/L;最佳退火温度为56℃。对该方法进行特异性试验,结果显示该方法可特异性的检测出CHUV、BCV和DAV核酸,而对环状病毒属的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒和广西环状病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对RNA标准品的最低检测限为6.9×10~1拷贝/μL。利用该方法检测血液样品,结果显示该方法检测结果与病毒分离结果基本一致。本研究建立的PALV一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感度高等优点,为开展PALV感染疫病诊断与流行病学研究提供了技术保障。 相似文献
16.
蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病.本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验.结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102 copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测.因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段. 相似文献
17.
为研究蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性,本实验将BTV-16型毒株接种在BHK-21、Vero、C6/36传代细胞系及山羊肾原代细胞,通过细胞敏感性试验、病毒感染生长曲线以及qRT-PCR方法检测BTV-16型毒株在上述不同细胞中的复制效率和增殖情况。试验结果表明,BTV-16型毒株在BHK-21、Vero、C6/36及山羊肾原代细胞中均能增殖,但产生CPE的时间及病毒滴度有所差异。病毒在BHK-21、Vero细胞上病变较快,山羊肾原代细胞次之,C6/36细胞病变不明显。从病毒滴度和核酸检测结果来看,病毒在BHK-21细胞中的增殖效率与Vero细胞基本一致,并且病毒在这两种细胞中的增殖效率明显高于在山羊肾原代细胞和C6/36细胞。本试验为蓝舌病病毒分离、抗原制备、致病性以及反向遗传学研究提供了细胞学研究基础。 相似文献
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本研究探讨了牛野生型蓝舌病毒血清8型(BTV-8)的垂直传播能力。研究人员发现了一例经胎盘传播感染了BTV-8的牛及另一例经口腔感染BTV-8的牛。对15头经产奶牛中的7头在怀孕8月龄时经试验感染BTV-8后,每头新生犊牛在初乳前均通过反转录实时定量PCR检测有无经胎盘传播的BTV。对未经胎盘传播感染该病的犊牛,喂给感染母牛或虽未感染却曾输入含BTV-8病毒血液母牛的初乳。其中1头感染母牛所产犊牛经反转录实时定量PCR检测为阳性,BTV特异性抗体检测为阴性,并在其血液中分离到BTV病毒。该牛出生后便伴有典型的蓝舌病症状,且仅存活2 d。尸检组织悬液经反转录实时定量PCR检测也为阳性。喂给感染母牛初乳的7头犊牛,无1头发生感染。喂给虽未感染却曾输入含BTV病毒血液母牛初乳的6头犊牛中,其中1头在产后第8天的检测中呈现PCR结果阳性,27 d后发生血清转换,PCR检测和抗体检测在整个试验期(即产后70 d内)始终为阳性。该研究结果表明,在牛怀孕后期胎盘传播以及新生牛通过口腔感染BTV-8在试验条件下是可行的。 相似文献
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用禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶将蓝舌病病毒RNA反转录成cDNA,以dATP、dGTP、dCTP、dTTP和bio-11-dUTP作为TaqDNA聚合酶的底物,应用PCR技术合成了生物素化蓝舌病病毒核酸探针,经斑点杂交试验证明,合成的探针为蓝舌病病毒特异性核酸探针。 相似文献
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《动物医学进展》2015,(9)
为建立一种检测并鉴别蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒和水泡性口炎病毒感染的方法,针对蓝舌病病毒NS3基因、口蹄疫病毒3D基因、小反刍兽疫病毒N基因和水泡性口炎病毒N基因序列设计引物,优化反应体系和扩增条件,建立了一种同时检测4种病毒的多重PCR方法。对建立的多重PCR检测方法的特异性及敏感性进行检验,结果表明建立的多重PCR检测方法敏感性强、特异性良好,对4种病毒的最低检出限分别为PPRV 103 copies/μL、BTV 103 copies/μL、VSV 103 copies/μL和FMDV 102 copies/μL。本方法的建立对临床感染蓝舌病等4种病毒的病畜进行快速检测具有十分重要的意义。 相似文献