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1.
从河南两个地区猪的粪便中分离纯化了猪源隐孢子虫卵囊。参考隐孢子虫Hsp70基因属特异性引物,用PCR分别扩增了卵囊基因组DNA大小均为1 948 bp的片段,PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化,纯化后PCR产物直接测序。将测得的序列和推测出的氨基酸序列分别用ClustalX软件与已报道的相应序列比对,用DNASTAR中的MegAlign分析其同源性,并用PAUP绘制系统发育进化树。序列分析结果显示河南猪源隐孢子虫两个分离株Hsp70 DNA序列的同源性为99.9%,与其他隐孢子虫相应序列同源性介于81.9%~99.8%之间,其中与猪隐孢子虫(Cryptosporidium suis,AF221533)同源性最高分别为99.8%,97.9%;与安氏隐孢子虫(C.andersoni,AY954592)同源性最低。两个分离株推导Hsp70氨基酸序列的同源性为100%,同其他隐孢子虫相关序列的同源性在92.8%~99.8%之间。本研究为隐孢子虫诊断及流行病学研究打下了良好基础。 相似文献
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应用RT-PCR方法对南京、上海和合肥猪源隐孢子虫卵囊SSU rRNA部分序列进行扩增,产物测序后提交GenBank,收录号为DQ855266、DQ855267;用BLAST和DNAStar软件与GenBank参考序列进行比较,分析其同源性,绘制系统发育进化树,结合卵囊形态学观察和对小鼠、大鼠、兔、山羊和鸡的传染性试验确定隐孢子虫种类或基因型。结果表明,3地区猪源隐孢子虫分离株与微小隐孢子虫(C.parvum)同源性达94%~100%,与C.parvummouse型有99.8%~100%的同源性,并处于进化树的同一分支。因此,3地区猪源隐孢子虫是C.parvummouse型,提示猪和鼠之间存在交叉传播的可能。 相似文献
3.
为克隆不同种隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)的半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因,分析其核苷酸与编码氨基酸序列的变异情况,根据GenBank上公布的微小隐孢子虫(C.parvum)Cryptopain-1基因序列设计合成引物,用PCR技术从不同种隐孢子虫基因组DNA中扩增Cryptopain-1基因,并将其克隆至pZeroBack/blunt载体,阳性克隆经PCR鉴定正确后测序,与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因进行序列同源性比对,并进行系统进化分析。结果显示,本研究成功从泰泽隐孢子虫(C.tyzzeri)、火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)、兔隐孢子虫(C.cuniculus)基因组DNA中扩增出Cryptopain-1基因。与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因比较,泰泽隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、兔隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸序列相似性分别为98.67%、94.53%、98.34%,演绎的氨基酸序列相似性分别为99.00%、96.51%、99.00%。研究结果为利用Cryptopain-1基因进行隐孢子虫的代谢、致病机理等研究奠定了基础。 相似文献
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采进口奶牛粪样200份,收集每份样品中的卵囊液,采用巢式PCR检测隐孢子虫(Cryptosporidium)18S rRNA基因,并用RFLP进行虫种鉴定,将目的片段克隆到pEGM-T easy vector,测序并进行同源性分析以进一步佐证虫种鉴定结果。结果表明,进口奶牛隐孢子虫阳性率为3.5%(7/200),514bp的目的片段不能被EcoT14 Ⅰ酶切。测序分析表明,获得的18S rRNA基因序列与NCBI上公布的微小隐孢子虫(C.parvum)相应序列同源性高达99.4%~100%,与安氏隐孢子虫(C.andersoni)同源性仅为91.1%。说明进口牛粪样中检测出的隐孢子虫为微小隐孢子虫。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2017,(24)
为了解新疆南疆牛隐孢子虫病的感染情况,从而为该病的防控提供理论依据,以新疆南疆某牛场牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计引物,采用巢式PCR方法鉴定了自然感染的新疆南疆牛源隐孢子虫,并对扩增出的目的片段进行了测序、同源性分析,并运用MEGA 5.0软件构建系统发育进化树。结果表明:检测材料能够扩增出目的片段;新疆南疆牛源隐孢子虫分离株的18S rRNA与广州微小隐孢子虫的同源性达100%,种系发育亲缘关系最近,处于同一分支,与宁夏、河南、黑龙江等地微小隐孢子虫的同源性达99%。说明新疆南疆牛源隐孢子虫分离株在种属上为微小隐孢子虫。 相似文献
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应用PCR检测隐孢子虫卵囊的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
隐孢子虫病是一种重要的人畜共患原虫病。为了在临床样品中更准确、快速地检测隐孢子虫卵囊，从初步纯化的含有不同数量隐孢子虫卵囊的样品中和含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中，直接提取DNA或用DNA纯化试剂盒对提取的奶牛粪便中卵囊DNA进行纯化之后用作PCR模板，用1对人工合成寡核苷酸作为PCR引物，扩增片段大小为452bp。优化了Mg^2 浓度、引物浓度和dNTP浓度，并进行了特异性检验。建立的PCR具有隐孢子虫属特异性，不仅扩增出新鲜样品DNA提取物中的目的片段，而且扩增出放置6年之久的DNA提取物中的目的片段。样品经过初步纯化之后，最低检测值100个卵囊／ml；从含有隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中提取DNA，尔后经过DNA纯化试剂盒纯化，PCR最低检测值为10^5个卵囊/g粪便。 相似文献
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应用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)建立了一种检测隐孢子虫(Cryptosporidium)的方法。试验中隐孢子虫卵囊纯化采用庶糖密度梯度离心法,以液氮-热水浴反复冻融及酚-氯仿抽提冷乙醇沉淀法制备模板DNA,根据隐孢子虫18S rRNA序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法。该方法特异性强,可检出牛源微小隐孢子虫(C.parvum)、羊源微小隐孢子虫(C.parvum)、牛源安氏隐孢子虫(C.andersoni)、鸡源贝氏隐孢子虫(C.baileyi)及猪源隐孢子虫(C.suis);敏感性高,该方法最低核酸DNA检测量达到10fg。初步应用结果表明,所建立的Nested PCR方法适合于隐孢子虫病的诊断和分子流行病学调查。 相似文献
9.
猴源人隐孢子虫的分离与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解感染不同灵长类动物的隐孢子虫种类以及与感染人的人隐孢子虫(C.hominis)之间的遗传差异,本研究采用形态学和分子生物学方法对猴源隐孢子虫进行分离和鉴定。利用常规方法分离猴粪便中的隐孢子虫卵囊,通过改良抗酸染色和荧光显微镜观察对其进行形态学鉴定;并采用PCR方法扩增其卵囊壁蛋白(COWP)基因和18SrRNA基因,扩增产物克隆至pMD-18-T载体中,对阳性克隆进行测序并作进化树分析。结果表明:抗酸染色和荧光检查结果与所报道的人隐孢子虫的结果一致。PCR扩增产物经电泳检测,明显地出现554bp和370bp大小的片段,与预期结果一致;两种基因的序列分析结果显示该猴源隐孢子虫与C.hominis的相似性均为100%。由此可认为本次分离的隐孢子虫为C.hominis。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2019,(7):1325-1329
本研究从河北省奶牛场有腹泻症状2月龄左右的犊牛粪便中分离卵囊,进行病原分离与虫株鉴定。采集腹泻犊牛的新鲜粪便24份,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和抗酸染色法检测隐孢子虫卵囊,观察卵囊形态、大小。提取卵囊基因组DNA,进行18S rRNA基因PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测。对扩增片段进行序列测定及分析,进一步确定分离虫株隐孢子虫的种类/基因型,根据18S rRNA基因核苷酸序列构建系统发育进化树,确定虫株亲缘关系。结果显示,5份样品检出隐孢子虫卵囊,感染率为20.83%。形态学观察卵囊呈长圆形或椭圆形,大小为(5.0～8.2)μm×(4.2～6.3)μm,平均大小为6.6μm×5.3μm,卵囊指数为1.24,鉴定分离虫株为安氏隐孢子虫。PCR扩增出预期大小为1 188 bp的特异性片段,序列分析和同源性分析结果表明,分离株与安氏隐孢子虫AB089285.2株、AB513856.1株、AY954885.1株的同源性为98.7%～98.8%,进一步表明分离的隐孢子虫虫株为安氏隐孢子虫。在种系进化关系上,分离株与安氏隐孢子虫AB513856.1株亲缘关系最近。本研究为揭示河北省奶牛隐孢子虫病的流行特征,实施有效防制措施提供了科学依据。 相似文献