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1.
在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白，能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性，即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏云金芽胞杆菌片段，本文构建了解离载体pBMB5401，并将上述两个融合基因单独或同时装入解离载体pBMB5401，分别得到重组质粒pBMBcaiiA，pBMB3aiiA和pBMB3439。转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171，随后导入温度敏感型辅助质粒pEG922，重组质粒在整合酶的作用下发生体内重组，消除了抗性基因等非必需片段。【结果】得到3个重组菌BMBcaiiAR，BMB3aiiAR和BMB3439R，在无抗性选择压力下的稳定性均在90%以上。融合蛋白SLH-AiiA及pro3A-AiiA在解离后的重组菌中得到表达，具有对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力。【结论】在苏云金芽胞杆菌中高效和稳定表达AiiA蛋白,可增强其对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力，当同时结合两种方式来表达AiiA蛋白时效果最好。 相似文献
2.
枯草芽胞杆菌是一种生物安全的革兰氏阳性细菌,在营养匮乏的环境下,可形成具有强抗逆性的芽胞。枯草芽胞杆菌的芽胞由核心、皮层、孢子外套蛋白三部分组成,目前已成功利用枯草芽胞杆菌芽胞外套蛋白CotB、CotC、CotG、CotX和OxdD为载体,将酶蛋白、抗原蛋白或荧光标记蛋白等展示于芽胞表面。芽胞表面展示的蛋白通常具有较好的稳定性、易于纯化和安全性好等优点,可应用于医药、食品及饲料工业等领域,具有较大的应用前景。详细介绍了枯草芽胞杆菌芽胞的分子特点及芽胞表面展示系统的构建过程及其应用前景,为芽胞表面展示载体的基础及应用研究奠定基础。 相似文献
3.
根据能形成伴胞晶体的特征，芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌幕虫亚种。但该菌株明显不同于典型的苏云金芽胞杆菌，因为其伴胞晶体蛋白并不是由杀虫晶体蛋白基因编码，而是编码细胞表面S-层蛋白基因的产物，且伴胞晶体蛋白没有检测到对昆虫的毒性。本研究基于对CTC菌株及参照菌的16S-23S rRNA间隔区、编码S-层蛋白的基因进行扩增并测序，从系统发育水平检测到CTC菌株明显与苏云金芽胞杆菌幕虫亚种典型菌株T02存在差异，表明芽胞杆菌CTC菌株更接近蜡状芽胞杆菌。 相似文献
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绿色荧光蛋白基因gfp在苏云金芽胞杆菌中表达的初步研究 总被引：2，自引：0，他引：2
将携带蜡状芽胞杆菌特异启动子的gfpmut3a基因克隆到穿梭载体pHT30 4后 ,电转化至苏云金芽胞杆菌BMB171,CryB、IPS78 11、4Q7、HD 80 2 1中。通过荧光显微镜和Bio assayReader对含重组质粒pGFP 30 4的 5个受体菌分别进行荧光检测及定量分析。结果表明 ,gfpmut3a基因仅在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171、CryB、IPS78 11、4Q7中表达并可检测得到菌体发光 ,并建立了一套适合于苏云金芽胞杆菌的GFP标记与检测方法。 相似文献
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以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因（gfp）序列，扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）整合载体pAXc，构建重组质粒pAXc-gfp. pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411，gfp编码序列通过同源泉重组整合列到B.subtilis B411染色体上，获得在无抗性选择压力下稳定表达绿色荧光蛋白的重组子B412. 相似文献
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将ｐＥＳＩ经ＥｃｏＲＩ酶解后回收纯化的含有苏云金芽胞杆菌ｃｒｙＩ基因高保守区的ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥＬＥＣＴ－１的ＥｃｏＲＩ位点，通过ＤＩＧ体外标记转录制备高灵敏度、背景清楚的ＲＮＡ探针，并利用该探针进行苏云金芽胞杆菌８０１０杀虫基因定位．结果表明，该菌株编码杀虫晶体蛋白的基因位于相对分子质量３７×１０６的质粒上 相似文献
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sigL基因编码的产物σ54是许多重要代谢途径的转录因子。为研究sigL基因在苏云金芽胞杆菌中的功能,试验分别测定苏云金芽胞杆菌HD-73菌株和sigL基因缺失突变菌株在基本培养基中对不同碳氮源的利用。结果表明,出发菌株和sigL突变体都不能利用果糖、蔗糖、纤维二糖、柠檬酸作为唯一碳源;sigL突变菌株不能利用肌氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和缬氨酸为唯一氮源,说明sigL缺失可能阻碍这些氨基酸参与的代谢途径。β-半乳糖苷酶活性分析表明,调控肌氨酸代谢途径的soxR基因转录活性在sigL突变体中降低,说明sigL是通过调控编码肌氨酸氧化酶的基因簇(sox)而影响菌体对肌氨酸的利用。 相似文献
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细胞表面展示有机磷水解酶的恶臭假单胞菌工程菌的构建及全细胞酶活性分析 总被引：4，自引：1，他引：3
利用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)冰核基因的N-末端(inpn)作为锚定单元(anchoring mo-tif),通过与来自黄杆菌属(Flavobacterium sp.)的有机磷水解酶基因(opd 构建融合基因inpn-opd,并连接于假单胞菌表达载体Pymbp,然后导入恶臭假单胞菌(P.putida)野生型菌株AB92019,获得了能在其细胞表面展示有机磷水解酶并具有全细胞酶催化活性的重组工程菌MMBL-opd.SDS-PAGE结果表明,融合基因能表达产生80 ku的蛋白质.重组菌MMBL-opd在无抗性LB固体培养基上能稳定生长,所携带的外源质粒的稳定性达到100%;在添加100 μmol/L Go2 培养基上28℃培养48 h,表面展示的有机磷水解酶具有最高全细胞酶活性,为0.036 U/mg.用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低92%.重组菌在PBS缓冲液中于4℃条件下保存30 d,仍能保持93%的全细胞酶活. 相似文献
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γ-氨基丁酸旁路(GABA shunt)普遍存在于原核和真核生物体中,对于动物、植物和微生物具有不同的生理功能.苏云金芽胞杆菌gab基因簇中gabT和gabD基因所编码的γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶参与GABA shunt.在前期研究获得的苏云金芽胞杆菌HD-73菌株gabT、gabR(gab基因簇中的调控基因)和gabD基因缺失突变菌株的基础上,从菌株生长、芽胞产量和晶体蛋白产量等方面研究GABA shunt阻断对Bt芽胞和晶体形成的影响.结果表明,GABA shunt阻断对芽胞产量有一定影响,但对Bt生长和晶体蛋白产量无明显影响 相似文献
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苏云金芽胞杆菌CT—43的芽胞萌发及芽胞和伴胞晶体的形成 总被引：3，自引：0，他引：3
在电镜下观察了苏云金芽胞杆菌菌株ＣＴ－４３的芽胞萌发、芽胞和伴胞晶体的形成过程。芽胞萌发分活化、萌动和脱出３个阶段。芽胞形成分为轴丝形成、前芽胞隔膜形成、前芽胞形成、初生细胞壁形成．芽胞外套形成、芽胞衣片层形成和芽胞形成７个阶段。伴胞晶体形成从芽胞形成第２阶段开始，由一些小结晶聚集而成。晶体镶嵌在菌株ＣＴ－４３中很普遍。结合实验对伴胞晶体形成的调控和外膜的形成等进行了讨论。 相似文献
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克隆了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株AS1. 2829的1种主要细胞壁自溶素-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶的编码基因acmAas,并对其编码蛋白AcmAas的结构进行了预测,发现该蛋白由1个具催化活性的N-末端和1个具细胞壁锚定活性的C-末端结构域组成,其中C-末端又由3个LysM(1ysin motif)结构域组成,具有典型的"βαβα"型二级结构.进一步通过体外在acmA基因中引入红霉素抗性基因(Emr)而构建具有与宿主菌染色体acmA基因进行整合作用的重组基因,并导人宿主菌后筛选得到发生染色体整合重组的重组菌株MB257,对该菌株的形态与生长特性进行了初步研究,结果表明该菌株所携带的acmAasN-lysm1基因在保留其N端结构域和1个lysM编码区后,其编码产物可发挥其完整生物学活性. 相似文献
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苏云金芽胞杆菌新菌株的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为筛选对昆虫有高力的苏云金芽胞杆菌特异性菌株,从韩国不同地区土壤中筛选出两株对鳞翅目和双翅目昆虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌菌株K9805和K9903,它们分属于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种和鲇泽亚种,形成典型的双金字塔型伴胞晶体,两菌株不但对小菜蛾、甜菜夜蛾具有较高的生命活性,而且对双翅目昆虫致倦库蚊有毒。K9805含有cry IAa,cy IAb,cry IC,cry ID和cry I基因,K9903含有cry IAa,cry IAb,cry IAc,cry IE和cry Ⅱ基因。 相似文献
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模拟自然界中云斑天牛Batocera horsfieldi(Hope)成虫的生活状态,建立室内人工饲养及生测方法,对苏云金芽胞杆菌(Bt)的杀虫活性进行测定。将苏云金芽胞杆菌菌悬剂涂抹在野蔷薇枝条表面,饲喂云斑天牛成虫,20 d后统计死亡率、体质量变化及产卵数量。在室内测定了80株苏云金芽胞杆菌的活性,通过1次初筛和2次复筛,筛选到1株对云斑天牛成虫有较高致死率的菌株ZQ-51。该菌株处理云斑天牛成虫后平均死亡率为53.33%,平均体质量减少率和平均产卵减少率分别是5.67%和12.48%,与对照差异均极显著。从感染死亡的成虫肠道中重新分离了该菌株,并验证分离的菌株与ZQ-51具有相似的形态特征和杀虫活性,表明苏云金芽胞杆菌可通过云斑天牛取食进入肠道而发挥杀虫作用。 相似文献
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在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达. 相似文献
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【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。 相似文献
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利用pMD18-T克隆载体从苏云金芽胞杆菌菌株WB12中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因(AHL-lactonase,aiiA).测序结果表明,该基因(GenBank登录号为DQ000642)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.推测该蛋白质分子质量为28 ku,等电点为4.2,不含信号肽序列.利用DNAMAN软件构建同源关系树.结果表明,该蛋白与已报道具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的11个A iiA蛋白酶氨基酸序列总相似性为81.2%,并含有相同的氨基酸序列保守区.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因(86%-99%). 相似文献
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经室内10代筛选,棉铃虫对苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520和HD-73伴胞晶体产生了一定水平的抗性,F10代的抗性指数分别为1.30和2.07。从中可以看出棉铃虫对苏云金芽胞杆菌抗性发展的初步规律,即棉铃虫对多基因毒素(YBT-1520ICPs)的抗性发展比对单基因毒素(HD-73ICPs)的抗性发展速度要慢得多。 相似文献
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根据cry1I类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BtMX2的总DNA为模板扩增出片段长为2.1 kb的cry1I的全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达栽体pEB,转化大肠杆菌Rosetta茵株,诱导表达出81 ku的蛋白,编码的... 相似文献