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1.
为探索冷冻保存对猪体细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化的影响,本研究以梅山猪耳成纤维细胞为材料,采用亚硫酸氢盐测序和RT-PCR技术,检测了新鲜和冷冻保存细胞中H19和IGF2R基因的DNA甲基化状态和表达量,并对甲基化相关基因的表达水平进行分析。结果表明:冷冻组中H19基因DMR1和DMR3的甲基化率极显著高于新鲜组(P0.01),H19基因DMR2表现为去甲基化,极显著低于新鲜组中的甲基化率(P0.01),且该基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01);冷冻组IGF2R基因DMR2表现为超甲基化,冷冻组极显著高于新鲜组中的甲基化率(P0.01),但IGF2R基因表达量无显著差异(P0.05);冷冻组中DNMT3A和DNMT1的基因表达量极显著高于新鲜组(P0.01),DNMT3B基因表达量则无显著差异(P0.05)。本实验条件下,冷冻保存影响了H19和IGF2R基因甲基化控制区的DNA甲基化状态,从而影响了该基因的表达水平。 相似文献
2.
为了探求核移植过程中DNA甲基化重编程是否充分,运用亚硫酸氢盐测序法分别检测新生死亡克隆猪和同期正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中IGF2/H19基因印迹控制区(DMR1、DMR2、DMR3)的甲基化状态。结果发现,DMR1、DMR3在克隆猪和正常猪各组织中的甲基化水平不同,但差异不显著(P＞0.05)。DMR2在克隆猪肺脏组织表现为超甲基化,极显著高于正常猪(P＜0.01),且10个测序克隆中存在2处连续的全甲基化CpG位点(分别为4－9位和12－17位),而在其它组织中甲基化差异不显著(P＞0.05)。说明DMR2在克隆猪肺脏组织可能存在DNA甲基化重编程紊乱,这也可能是导致该克隆猪死亡的因素之一。 相似文献
3.
为了探求新生克隆猪可能的死亡原因以及是否存在不完全的DNA甲基化重编程,本试验运用亚硫酸氢盐测序法分别检测了H19基因和IGF2R基因差异甲基化区（DMR）在新生死亡克隆猪和同期正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的甲基化状态。结果发现,H19基因DMR在克隆猪肺脏中表现为超甲基化,极显著高于正常猪（95．20％VS46．80％P〈0．01）,且10个测序克隆中存在2处连续的全甲基化CpG位点（4-9位、12-S17位）,而在其他组织中甲基化差异不显著（P〉0．05）;IGF2R基因DMR在肝脏中处于超甲基化状态,显著高于正常猪（80．00％V839．41％P〈0．05）,而在肺脏中为去甲基化状态,板显著低于正常猪（14．71％VS66．47％P〈0．01）,在其他组织差异不显著（P〉0．05）。结果说明,在死亡克隆猪中,H19基因DMR在肺脏和IGF2R基因在肝脏与肺脏中存在不完全的DNA甲基化重编程,这可能是导致克隆动物死亡的因素之一。 相似文献
4.
本试验通过实时荧光定量PCR方法对多能基因Oct4和Nanog及DNA甲基化相关基因Dnmt1和Tets在徒手克隆（handmade cloning,HMC）胚胎中的表达模式进行初步研究,并探讨5-Aza-CdR处理重构胚对这些基因表达模式的影响。结果显示,Oct4、Nanog和Tet3的表达在2细胞时期达到顶峰,Dnmt1和Tet2基因的表达随HMC胚胎发育而下降,而Tet1基因随HMC胚胎发育表达上升。使用5-Aza-CdR处理重构胚没有改变Oct4、Tet1和Tet3基因的表达模式,使Nanog基因在胚胎发育初期表达增加,Dnmt1和Tet2基因在胚胎发育初期表达降低。研究初步确立了Oct4、Nanog、Dnmt1和Tets基因在HMC胚胎的表达模式,5-Aza-CdR对重构胚的处理可对HMC胚胎的甲基化模式产生影响。 相似文献
5.
《中国饲料》2020,(15)
为研究HT-2毒素对小鼠MII期卵母细胞甲基化基因及DNA甲基化的影响,试验将24只小鼠随机分为4组,根据饲料标准设置HT-2毒素浓度分别为1、1.5、2 mg/kg及空白对照组。连续灌胃16 d后进行超排,测定小鼠卵巢的重量,采集小鼠MII期卵母细胞,通过使用实时荧光定量PCR和激光共聚焦的方法对小鼠卵母细胞Tet1、Tet2、Tet3甲基化基因表达及DNA甲基化进行研究。结果表明:(1)2 mg/kg组小鼠卵巢重量较对照组极显著降低(P 0.01);2 mg/kg组较1、1.5 mg/kg组显著降低(P 0.05);其他各组间差异不显著(P 0.05)。(2)Tet1、Tet2基因表达水平试验组和对照组相比差异不显著(P 0.05);2 mg/kg组Tet3基因表达水平较对照组极显著降低(P 0.01);2 mg/kg组较1、1.5 mg/kg组显著降低(P 0.05);其他各组差异不显著(P 0.05)。(3)在激光共聚焦试验中,5-甲基胞嘧啶(5-mC)的荧光平均光密度(AO值)中,1.5、2 mg/kg组较对照组和1 mg/kg两组极显著提高(P 0.01);1.5 mg/kg组与2 mg/kg组差异极显著(P 0.01);其他组别间无显著差异(P 0.05)。5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的AO值中,1.5、2 mg/kg组较对照组和1 mg/kg组极显著提高(P 0.01);其他各组差异不显著(P 0.05)。各梯度中5-mC和5-hmC平均光密度值间差异极显著(P 0.01)。综上所述,HT-2毒素可通过降低小鼠MII期卵母细胞Tet3基因的表达水平从而提高DNA甲基化水平。 相似文献
6.
7.
《中国畜牧杂志》2021,(8)
实验旨在探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖能力、DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,为水牛体细胞克隆中供体细胞的选择提供理论依据。利用细胞组织块培养法分离培养3月龄胎儿水牛、新生水牛、10岁龄水牛的耳部成纤维细胞,通过绘制细胞生长曲线、细胞免疫荧光和qRT-PCR方法分析细胞增殖能力和DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平。结果表明:随着水牛年龄增长,原代成纤维细胞扩展速度不断下降,P2代细胞的生长曲线呈典型的S型,3月龄胎儿水牛成纤维细胞的增殖能力均高于新生水牛和10岁龄水牛(P0.05);3月龄胎儿水牛与新生水牛的DNA甲基化水平低于10岁龄水牛(P0.01),3月龄胎儿水牛成纤维细胞的DNA甲基化转移酶基因DNMT1、DNMT3A低于新生水牛和10岁龄水牛(P0.01);随着年龄增长,水牛成纤维细胞组蛋白乙酰化转移酶HAT1基因的表达降低(P0.01),组蛋白去乙酰化酶HDAC1基因的表达升高(P0.01)。以上结果说明,水牛胎儿成纤维细胞处于低DNA甲基化高组蛋白乙酰化状态,可能更适合作为供体细胞用于水牛体细胞克隆研究。 相似文献
8.
《中国兽医杂志》2018,(11)
虽然体细胞克隆技术已经在多种动物获得成功,但是仍然存在效率低、克隆胚胎发育异常等问题,严重限制了该技术的应用。为提高克隆效率,探讨克隆动物发育异常的原因,本研究对1例死亡克隆牛主要内脏器官进行了组织学观察,并对其胎盘印记基因甲基化状态进行分析。结果表明,此例死亡克隆牛主要内脏器官除肾脏外,均不同程度出现充血、增生及淋巴细胞浸润等病理变化。胎盘增生明显并伴有充血,胎盘中印记基因H19及Peg-10的甲基化水平分别为84.6%和88.6%,显著高于50%,出现超甲基化状态。推测体细胞核移植过程影响了供核细胞的表观重编程,导致了印记基因H19及Peg-10的迷乱的DNA甲基化状态,并影响胎盘及内脏器官的正常发育。 相似文献
9.
本实验旨在研究C型钠肽(CNP)预处理对绵羊卵母细胞体外成熟(IVM)及相关基因(Dnmt1、Zar1、Mater、HAS2、PTX3和PTGS2)表达的影响。以体外成熟24 h为对照组,研究CNP预处理组(200nmol/L CNP预处理4 h然后体外成熟24 h)中卵母细胞经孤雌激活(PA)后的发育情况,并通过RT-q PCR检测CNP预处理对成熟相关基因表达的影响。结果表明:200 nmol/L CNP可在4 h内有效抑制卵母细胞减数分裂进程。CNP预处理组中孤雌胚胎囊胚率显著高于对照组(P0.05);绵羊卵母细胞成熟培养前,CNP预处理组中卵丘细胞扩展相关基因HAS2、PTGS2和PTX3表达量较对照组极显著上调(P0.01);CNP预处理组中母源基因Dnmt1、Zar1和Mater表达量与对照组均无显著差异(P0.05)。绵羊卵母细胞成熟培养后,CNP预处理组中PTX3表达量极显著高于对照组(P0.01),而CNP预处理组中HAS2表达量较对照组极显著下调(P0.01);CNP预处理组中母源基因Dnmt1、Zar1和Mater表达量均显著高于对照组(P0.05)。综上表明,CNP预处理可影响绵羊卵丘细胞扩展相关基因HAS2、PTGS2、PTX3和母源基因Dnmt1、Zar1、Mater的表达,并提高绵羊卵母细胞成熟质量及早期胚胎发育能力。 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2016,(3)
本研究利用RT-PCR、TA克隆和重亚硫酸盐测序(BSP)等方法,旨在克隆、分析山羊STAT3基因完整编码区,并解析该基因甲基化修饰水平及其与体重的关系。结果表明,山羊STAT3基因编码区全长2 313bp,编码770个氨基酸;与绵羊、牛、野猪、小鼠、大鼠和人的氨基酸序列一致性分别为99.7%、99.6%、99.4%、99.2%、99.4%和99.5%。山羊高体重组与低体重组之间甲基化差异研究发现,高体重组STAT3基因启动子区甲基化水平显著高于低体重组(P=0.020),提示该基因甲基化修饰对体重具有显著影响,可作为标记辅助选择(MAS)的有效表观遗传标记。这些结果为研究山羊肉用性能的遗传与表观遗传机制提供了科学资料。 相似文献
11.
旨在探究DCT基因启动子区甲基化水平和SNP突变对山羊毛色的影响,为探索DCT基因调控山羊毛色变化的机理提供理论依据。本研究以山羊为试验动物,对DCT基因启动子区进行CpG岛预测,设计引物对预测的2个CpG岛富集区域进行亚硫酸氢盐甲基化测序,使用甲基化水平分析软件BISMA统计甲基化位点,比较唐山奶山羊(白色)和南江黄羊(黑色品系)两种不同毛色山羊群体DCT基因启动子区甲基化水平差异。克隆DCT基因核心启动子区,筛选不同毛色山羊群体的SNPs,使用JASPAR和Nsite预测SNPs位点突变前后转录因子的改变,并检测比较突变前后DCT基因启动子活性变化。结果,成功克隆了山羊DCT基因启动子区甲基化序列及核心启动子区(g.-1045～-318)。在g.-348～-150区域和g.+222～+502区域分别发现6个和23个甲基化位点,其中g.+312、g.+352和g.+400位点与g.+389和g.+404位点白色山羊甲基化水平分别显著和极显著高于黑色山羊(P<0.05和P<0.01),并且g.+222～+502区域白色山羊甲基化平均水平极显著高于黑色山羊(P<0.01)。在DCT基因核心启动子区的g.-804T> G、g.-705C> T和g.-679G> A,3个SNPs位点的基因型构成在白色山羊和3个有色山羊群体中存在差异,g.-804T> G突变导致该区域的SOX10转录因子结合位点缺失,DCT基因启动子活性显著下降(P<0.05)。结果显示,白色山羊DCT基因g.+222～+502区域的高甲基化水平,g.-804、g.-714和g.-679 3个位点的突变,尤其是g.-804T> G造成SOX10转录因子结合位点的缺失,突变的G型DCT基因启动子活性显著降低。因此,DCT基因启动子区SNP突变和高甲基化水平可能抑制了基因的表达从而形成山羊白色被毛。 相似文献
12.
用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。 相似文献
13.
14.
《畜牧兽医学报》2016,(2)
本试验旨在研究胚期注射叶酸对肉鸡脾和胸腺中IGF2基因表达的影响,并进一步探究其调控基因表达的表观遗传学机制。选择重量和大小相近的种蛋360枚,随机分为4组,在孵化期第11天(E11)分别注射0(对照)、50、100和150μg的叶酸。每个处理选取体重相近的48只1日龄雏鸡,随机分为6个重复,每个重复8只鸡,在饲养的第21和42天取胸腺和脾组织。用RT-PCR方法检测组织中IGF2的相对表达量;重亚硫酸盐修饰克隆测序法(BSP)检测IGF2启动子区域(-648/-479bp)甲基化水平;DNase I-qPCR方法检测IGF2启动子区域(-847/-616bp)染色质构象。结果表明,胚期注射100和150μg叶酸显著提高了受精蛋孵化率(P0.05);胚期注射150μg叶酸显著提高了42日龄脾中IGF2的表达量(P0.05)、降低了42日龄脾中该基因启动子区的甲基化水平(P0.05),并且也显著增加了42日龄脾中IGF2启动子区的染色质可接近度(P0.05);然而在21日龄时各叶酸处理组对脾中IGF2的表达均无显著影响(P0.05)。与脾组织不同,150μg叶酸处理组显著提高了21日龄胸腺中IGF2的表达(P0.05),对42日龄胸腺中该基因的表达却没有显著影响(P0.05),并且与对照组相比,150μg叶酸处理组中21日龄胸腺组织IGF2启动子区的染色质可接近度也显著增加(P0.05)。由此可见,在种蛋孵化第11天注射叶酸可通过影响基因启动子区的甲基化水平和染色质构象来调控组织中IGF2的表达,并且存在组织器官和时间特异性。 相似文献
15.
为了探讨H19基因CpG岛甲基化变化对克隆羊及后代羊生长的影响,试验采用亚硫酸盐测序法分析成活克隆羊原代、后代与普通羊血细胞中H19基因CpG岛甲基化水平。结果表明:克隆羊原代(71.00%、70.00%)、后代(67.50%、68.50%)H19基因CpG岛甲基化水平与对照组(77.00%、66.00%)相比差异不显著(P0.05),但对照组H19基因CpG岛甲基化水平显著差异(P0.05),说明克隆羊与后代羊血液H19基因CpG岛甲基化水平接近,不会影响克隆动物及其后代的生长,但血细胞H19基因CpG岛甲基化水平与品种有关。 相似文献
16.
《中国兽医学报》2019,(1):163-170
旨在探讨Scriptaid和5-Aza-CdR共同处理水牛耳部成纤维细胞(buffalo adult fibroblasts,AFs)对细胞生长特性、DNA甲基化和组蛋白乙酰化的影响,为提高水牛体细胞重编程效率提供一定的理论基础。首先使用不同浓度的Scriptaid(0,0.05,0.10μmol/L)和5-Aza-CdR(0,0.02,0.10μmol/L)分别处理AFs,筛选出最佳处理浓度后联合处理AFs 24h。随后采用免疫荧光染色技术分析联合处理后细胞的DNA甲基化和组蛋白H3K18乙酰化变化情况,并使用实时荧光定量PCR(QPCR)技术对其甲基化和乙酰化相关基因的表达进行检测。结果发现,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)对细胞正常的形态、生长无显著影响。与对照组相比,联合处理后AFs中DNA甲基化水平显著降低,而组蛋白H3K18位点的乙酰化水平显著上升(P0.05)。QPCR分析结果显示,联合处理后AFs中的DNA甲基化相关基因Dnmt1、TET1和TET2的表达水平均出现下调,其中Dnmt1的表达水平显著低于对照组(P0.05);组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2的表达水平也出现下调,其中HDAC1下调显著(P0.05);而组蛋白乙酰化转移酶CBP,P300和HAT1的表达水平出现上升,其中P300和HAT1的表达水平显著高于对照组(P0.05)。结果表明,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)联合处理AFs,对细胞形态和生长无显著影响,但可以有效降低细胞甲基化水平并提高组蛋白H3K18位点的乙酰化水平。 相似文献
17.
《中国兽医学报》2017,(11):2222-2226
对藏猪睾丸组织基因组DNA甲基化水平与Dnmt3a、HIF2α基因mRNA表达水平的相关性进行研究。以大约克猪为对照,采用荧光法测定藏猪睾丸组织基因组DNA甲基化水平,采用实时荧光定量PCR技术测定DNA甲基化转移酶3a(Dnmt3a)与低氧诱导因子2α(HIF2α)的基因在藏猪睾丸组织中mRNA表达水平。结果显示:藏猪睾丸基因组DNA甲基化水平(0.392 9±0.099 2)%显著低于大约克猪睾丸基因组DNA甲基化水平(0.901 7±0.146 7)%(P<0.05);藏猪睾丸组织中Dnmt3a基因mRNA相对表达量(0.071 6±0.036 6)%显著低于大约克猪睾丸组织中Dnmt3a基因mRNA相对表达量(0.987 8±0.137 0)%(P<0.05);藏猪HIF2α基因mRNA相对表达量(0.158 8±0.066 1)%也显著低于大约克猪HIF2α基因mRNA相对表达量(1.2930±0.0756)%(P<0.05)。通过对藏猪睾丸基因组DNA甲基化水平与该组织中Dnmt3a和HIF2α基因mRNA表达量进行相关性分析,发现存在线性正相关,R2值分别达到0.846 3和0.917 4,这将为藏猪睾丸低氧适应性的DNA甲基化机制及藏猪的分子育种等相关研究奠定基础。 相似文献
18.
《畜牧兽医学报》2016,(6)
本研究旨在克隆BB基因型小尾寒羊的BMPR-IB基因编码区,构建重组载体,瞬时转染绒山羊成纤维细胞,并对BMPR-IB等基因的表达情况进行检测。采用RT-PCR方法扩增BMPR-IB基因完整编码区,构建真核表达载体pEGFP-BMPR-IB,经脂质体Lipofectamine LTXPLUS介导转染绒山羊成纤维细胞,并分别于转染后48和72h收集细胞,分别提取RNA和蛋白,利用RT-PCR和Western blot方法检测相关基因的表达情况。结果扩增得到了包含BMPR-IB基因完整编码区全长在内的1 550bp片段,与已知序列高度同源;Real-time PCR检测结果均表明,转基因组细胞中BMPR-IB表达量显著高于空白对照组(P0.01),IGF-Ⅰ基因表达量也显著上调(P0.01),TLR4、IFN、MHC、PNRP、GDF5、INH基因的表达量显著降低(P0.01);Western blot检测表明,转染组BMPR-IB、IGF-I的表达有所增加,BMP4、TLR4的表达略有降低,但差异均不显著(P0.05)。本研究成功实现了小尾寒羊BMPR-IB基因在山羊成纤维细胞中的表达,为转BMPR-IB基因阳性细胞株和细胞系的建立提供了基础;研究表明BMPR-IB(BB型)基因的过表达能上调IGF-Ⅰ基因的表达,下调TLR4基因的表达。 相似文献
19.
《中国草食动物科学》2010,(2)
为探讨母源基因在绵羊卵母细胞和胚胎发育过程中的表达模式,运用Real-time PCR技术研究4种母源基因:Gdf9(生长分化因子9)、Zar1(合子阻泄因子)、Mater(胚胎必要的母体抗原)及Dnmt1(DNA甲基化转移酶1)的mRNAs在绵羊GV期卵母细胞,24h成熟卵母细胞,2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞胚胎以及囊胚中的含量变化情况。结果表明:在GV期卵中Zar1、Mater、Gdf9以及Dnmt1m RNA相对含量最高(P0.05);从2-细胞胚胎开始,4种基因的mRNA相对含量显著降低(P0.05),各基因mRNA的含量在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎中存在动态变化,这对卵子生长和胚胎发育有重要意义。 相似文献
20.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(11)
为获得金毛犬睾丸组织成纤维细胞,试验采用胰蛋白酶消化睾丸组织,对成纤维细胞进行体外分离、培养及冻存,用RT-PCR法鉴定成纤维细胞特异基因波形蛋白(vimentin),观察比较第2代(P2)及第5代(P5)细胞生长曲线、群体倍增时间、克隆形成率。结果表明:用胰蛋白酶法消化睾丸组织获得的成纤维细胞呈典型的纺锤状,其可以表达特异基因vimentin,P2及P5细胞生长曲线均呈"S"型, P2及P5成纤维细胞群体倍增时间差异不显著(P0.05);P2成纤维细胞的克隆形成率显著高于P5(P0.05)。说明通过胰蛋白酶法消化睾丸组织可高效分离和获得犬睾丸成纤维细胞。 相似文献