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黄烷酮3-羟化酶(F3H)是植物花青素合成代谢中早期重要关键酶之一,对花色起着重要的调控作用.根据其它物种的f3h基因设计简并引物,通过RT-PCR技术,从非洲菊中克隆到500 bp的片段,经Blast N比时,证实该片段为非洲菊f3h基因保守片段.将其反向插入到高效表达载体pCAMBIA1304+CaMV 35S启动子下游,通过PCR鉴定和双酶切鉴定表明成功构建高效反义表达栽体pCAMBIA1304+-antif3h,并转化到根癌农杆菌LBA4404形成工程菌株,作为今后研究非洲菊花色调控机制以及培育新品种的有力工具. 相似文献
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【目的】 筛选新疆野苹果响应NaCl胁迫相关差异miRNA及靶基因。【方法】 以新疆野苹果组培苗为材料,对150 mmol/L NaCl处理6和48 h时的新疆野苹果幼苗叶片进行small RNA测序。【结果】 NaCl处理6 h时3个miRNA差异表达,其中2个上调表达,1个下调表达,miRNA对应的靶基因数目为64个;NaCl处理48 h时13个miRNA差异表达,其中4个上调表达,9个下调表达,miRNA对应的靶基因数目为108个。对差异靶基因进行GO和KEGG分类注释,NaCl处理6 h时,GO主要富集包括:肌醇磷酸2激酶活性、寡糖基转移酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂活性、木聚糖生物合成过程等;NaCl处理48 h时,GO主要富集包括:氧氧化还原酶活性、DNA结合、质外体、次生代谢过程等。KEGG共同富集在N-glycan生物合成通路。【结论】 mdm-miR168b、mdm-miR159c、mdm-miR827、mdm-miR390f、mdm-miR171i、mdm-miR399j基因在NaCl处理6和48 h时表达量存在差异,其中mdm-miR390f及其靶基因HF10976、mdm-miR171i及其靶基因HF33844、mdm-miR399j及其靶基因HF11095表达量呈负相关,3个miRNA参与了新疆野苹果对NaCl胁迫的响应过程。 相似文献
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【目的】在昆虫草地贪夜蛾细胞(Sf9)中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因RjAa17f。【方法】运用杆状病毒真核表达系统表达RjAa17f毒蛋白,并用蛋白质印迹对其进行检测;测定RjAa17f毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化,并对其毒力进行测定。【结果】通过重组杆状病毒质粒的转染和Western blot检测验证,神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中,且在Sf9中表达出与预测大小一致的RjAa17f目的蛋白;此毒蛋白作用于棉铃虫中肠3~12h后,中肠膜电位与CK相比差异显著,且随着作用时间的延长,棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势,作用9h以后,升高的幅度逐渐降低,趋于平缓。RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的LD50为108.12μg/g。【结论】在Sf9细胞内表达出了有活性的RjAa17f毒蛋白,且该毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位有显著改变。 相似文献
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为探究细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase 5，CDK5）在小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）新菌系CYR34夏孢子萌发过程的毒性作用，以天水地区小麦条锈菌新菌系CYR34夏孢子标样为试材，通过RACE克隆 CDK5基因并对其进行生物信息学分析，获得长度为706 bp，编码190个氨基酸的cDNA序列。蛋白质结构预测显示，其二级结构主要以α-螺旋为主，且具有典型的STKC激酶结构域。同源性分析显示，CDK5与小麦杆锈菌（Puccinia graminis f. sp. tritici）中的CDK5亲缘关系较近。蛋白质互作数据库预测分析发现，CDK5可以与磷酸核酮糖3-差异构酶、荚膜生物合成蛋白、鸟苷酸激酶、丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶、16S rRNA 蛋白以及肌苷-5′-单磷酸脱氢酶6个蛋白互作关系；基因时序表达发现在孢子萌发0~6 h时，基因的表达量持续下调，6 h后表现为上调，萌发10 h后为对照的1.2倍，萌发14 h后基因的表达量达趋于平台期，为对照的1.36倍。综上所述，推测细胞周期蛋白依赖性激酶CDK5在小麦条锈菌（CYR34）夏孢子萌发过程中参与了适应环境的信号调控。 相似文献
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旨为探索bta-miR-2285f和宿主基因TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)的生物学功能,以及bta-miR-2285f与靶基因互作调节奶牛乳脂代谢的潜在机制,本研究通过生物信息学方法分析bta-miR-2285f在不同物种间的保守性,并通过上游序列CPG岛分析、启动子预测、进一步进行组织表达谱分析,预测靶基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用双荧光素酶报告试验验证bta-miR-2285f调控的下游靶基因钙结合蛋白39(Calcium binding protein 39,CAB39),并在乳腺上皮细胞水平探究bta-miR-2285f的功能作用。结果表明：1)bta-miR-2285f是牛特异性miRNA,属于内含子miRNA;2)bta-miR-2285f与宿主基因TBK1上游序列2 kb处均不含有CPG岛。bta-miR-2285f在上游586 bp处为转录起始位点。宿主基因TBK1在上游105 bp处为转录起始位点;3)TargetScan和miRWalk预测miR-2285f有172个交集靶基因,主要参与新陈代谢、遗传信息传... 相似文献
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将草菇菌株V23和耐低温诱变草菇菌株VH3的菌丝体在4℃低温条件下处理不同时间后.分别提取总RNA,反转录获得cDNA作为待测模板,构建含Cor4基因和GPD内标基因片段的质粒作为标准品,采用荧光定量PCR技术中的双标准曲线法研究了Cor4基因在低温下的表达变化.结果表明:草菇V23菌株的Cor4基因未经低温处理的表达量最大,低温处理后表达量持续下降,在6 h达到最低值,8 h和10 h该基因的表达量略有回升;而VH3菌株Cor4基因低温处理后表达量呈上升趋势,至4 h达最高值,6 h时略有下降,8 h达最低值,10 h又开始上升,8 h和10 h均低于0 h表达量. 相似文献
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肌球蛋白轻链1基因(MYL1)的2个剪切体MLC1f及MLC3f在骨骼肌不同发育时期中发挥着重要作用。为进一步了解MYL1基因在猪骨骼肌发育过程中的重要作用,通过电子克隆、RT-PCR扩增及实时定量PCR方法克隆和鉴定了猪MYL1基因mRNA 5个选择性剪切体(MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)。其中MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C是在猪背最长肌中鉴定到的MYL1基因的3个新转录本,目前在人、鼠等其它物种尚无这三种转录本的报道。结果表明,剪切体MLC3f在180日龄长白猪中的表达量最高,而剪切体MLC1f则是在90日龄蓝塘猪的表达量最高;剪切体MLC5f-A在蓝塘与长白猪中各发育时期的表达量都很低;除了剪切体MLC1f外,其余转录本的表达量均为随个体体重的增加而逐步增加。通过对MYL1基因不同选择性剪切体的鉴定,为其在骨骼肌不同发育阶段或组织类型特异性表达调控研究奠定了基础,为该基因功能的研究提供重要线索。 相似文献
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《新疆农业科学》2017,(2)
【目的】克隆绵羊真核翻译起始因子eI F3h,构建原核表达载体,并诱导外源蛋白表达,检测、鉴定带有His标签的目的蛋白。【方法】根据Genbank中绵羊eI F3h基因CDS序列设计引物,PCR特异扩增DNA片段,酶切、连接至pE T28α(+)载体,将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株中诱导eI F3h蛋白表达。采用SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况,利用Western blot技术检测、鉴定目的蛋白。【结果】正确、完整的克隆到绵羊eI F3h基因CDS区序列,片段全长1 059 bp。将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株后,在37℃,1 mmol/L浓度的IPTG诱导3.5 h后获得以包涵体形式存在的目的蛋白,分子量大小约为40 kD。【结论】获得了完整、正解的绵羊eI F3h基因CDS区序列片段,构建了该基因的原核表达载体,成功诱导了绵羊eI F3h基因外源表达的目的蛋白,为绵羊eI F3h基因的后续研究提供了科学数据。 相似文献
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根据14-3-3蛋白的保守性及菜豆基因组信息,从普通菜豆品种东北小油豆中克隆了一个14-3-3蛋白基因PvGF14h.生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白以α螺旋为主导结构,具有典型的14-3-3蛋白结构域,主要分布在细胞质与过氧化体中,具有磷酸化位点;序列比对及进化树分析表明,它与大豆14-3-3蛋白SGF14h有较高的同源性(可达98.1％);进一步利用实时定量RT-PCR分析PvGF14h响应冷胁迫的表达模式,结果表明该基因的表达随着冷胁迫处理时间的增长而增加,因此推测PvGF14h可能参与了冷胁迫的信号转导过程.这些关于菜豆14-3-3蛋白基因的基本信息为进一步研究其功能尤其在响应低温胁迫方面奠定了基础. 相似文献
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应用电子克隆和RT-PCR方法,从小麦叶片中首次分离出1个条锈菌诱导的编码C3HC4型锌指蛋白基因的cDNA序列,暂被命名为TaZFP1。TaZFP1包含一个完整的849 bp的开放阅读框,编码282个氨基酸,具有C3HC4保守结构域;小麦TaZFP1氨基酸序列与水稻OsZFP1相似性达89%,与玉米ZmZFP1相似性达81%。TaZFP1在小麦根、茎、叶组织中表达量基本一致。在小麦与条锈菌的亲和、非亲和互作中,TaZFP1基因均受条锈菌诱导高水平表达,且非亲和组合表达量高于亲和组合,表明TaZFP1可能参与小麦对条锈菌的防御反应。 相似文献
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[目的]为今后深入了解茉莉酸诱导橡胶树乳管分化的分子机理奠定基础。[方法]根据bHLH转录因子基因保守区设计引物,以橡胶树树皮RNA反转录第一链cDNA为模板,获得橡胶树树皮组织bHLH基因的EST序列,以此序列设计巢式引物,应用3′RACE技术对其三端序列进行克隆,并利用半定量RT-PCR分析该基因在茉莉酸处理后4 h、8 h、1 d、2 d、3 d的表达情况。[结果]克隆共得到1 084 bp的HbbHLH基因3端序列,序列分析发现该基因属于MYC型HLH结构域。表达分析结果显示,茉莉酸处理后,bHLH基因在8 h内表达逐渐增强,1 d、2 d时表达稳定最高,3 d时表达水平开始减弱。[结论]茉莉酸对HbbHLH基因的表达具有调控作用。 相似文献
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长角血蜱卵cDNA表达文库的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo（dT）引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106 PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109 PFU•ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素（DQ248886）的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。 相似文献
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西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因CIMYB转录因子,进行生物信息学及表达模式分析,为进一步解析CIMYB在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和Microarray数据分析,获得与西瓜抗枯萎病相关的基因CIMYB,采用RT-PCR技术分离克隆CIMYB c DNA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征;使用MEGA5.0对CIMYB蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;采用GFP标记的方法进行亚细胞定位,分析编码蛋白表达位置;将该基因片段通过Nde I和Xba I双酶切连接至原核表达载体p Czn1,重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express,经终浓度为0.5 mmol·L~(-1) IPTG诱导4 h,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸(jasmonate,JA)诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从西瓜野生材料PI296341-FR根系组织中克隆该基因片段(Gen Bank:KT751229),序列比对及生物信息学分析表明,其基因编码的氨基酸序列具有MYB转录因子R2R3型的典型特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,C端高度变异。多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与甜瓜MYB(Gen Bank:XM_008440304)和黄瓜MYB(Gen Bank:XM_011652633)同源性最高,其编码的氨基酸一致性达到86%,这与它们同属葫芦科植物有关;亚细胞定位显示CIMYB定位于细胞核,为典型的转录因子;成功构建了该基因的原核表达载体p Czn1-CIMYB,转化至大肠杆菌得到36 k D左右蛋白;CIMYB受枯萎病菌诱导,在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中,相对感病品种表达量高峰出现的早,且表达量高。50μmol·L~(-1)的Me JA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平,同时诱导CIMYB表达,与抗病材料PI296341-FR相比表达趋势一致,但表达量更高。【结论】CIMYB为典型的R2R3-MYB转录因子,亚细胞定位于细胞核中;基因的原核表达得到36 k D的融合蛋白,在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸诱导,推测CIMYB可能参与JA介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路,在西瓜抗病中起一定的作用。 相似文献
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不同光周期对紫苏生长发育的影响和LFY同源cDNA片段的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
采用10h和16h两种光照条件对紫苏进行处理,观测光周期对紫苏生长发育的影响,结果表明：与短日照条件下的相比,长日照条件下生长的供试材料叶片数增加,叶片增大,茎增粗,植株增高,开花延迟;花芽分化从萼片原基形成开始,到雌蕊形成为止,持续3~4d。以该时间段的花芽为试验材料,运用RT-PCR方法,克隆得到1个445bp的 LFY同源基因cDNA片段,命名为PLFY。序列分析表明：该片段与彩叶草的FLO1,花椰菜的BOFH ,鼠尾草的FLOA2,拟南芥的LFY,金鱼草的FLO同源性依次为90%,67%,91%,67%,80%。 相似文献
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西瓜与枯萎病菌非亲和互作的表达序列标签分析 总被引：5，自引：1，他引：4
目的从整体水平上阐明西瓜与枯萎病菌非亲和互作基因表达的特征。方法用SSH方法构建枯萎病菌接种处理后不同时间点的cDNA文库,对其中获得3895条高质量的表达序列标签(EST)序列进行分析。结果在测定4431条cDNA序列中,序列拼接后获得1756条unigene,经过注释和分析,发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因,及茉莉酸和木质素生物合成途径等。结论在西瓜与枯萎病菌互作的SSH-cDNA文库中,与抗病防御相关基因约占36.3%,初步了解了西瓜与枯萎病菌非亲和互作过程中基因表达信息,这些基因的发现为在分子水平上研究西瓜与枯萎病菌的互作机制以及相关重要基因的克隆与功能分析奠定基础。 相似文献
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不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析 总被引：4，自引：0，他引：4
运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2. 相似文献
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【目的】明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)中与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中抗性相关WRKY转录因子的基因结构及其表达模式。【方法】采用RACE结合RT-PCR方法克隆cDNA序列,并根据cDNA序列设计特异引物扩增DNA序列,Southern杂交确定基因拷贝数,实时荧光定量PCR方法分析该基因在线虫侵染后辣椒的不同组织和不同时间点的表达。【结果】从辣椒中克隆到一个WRKY转录因子基因CaRKNIF2(GenBank登录号：GQ253367),该基因编码区全长1 662 bp,编码553个推定的氨基酸,为单拷贝基因。CaRKNIF2基因编码区全长DNA序列2 530 bp,包含5个内含子和6个外显子。在线虫接种诱导处理时,该基因表达具有组织特异性,根尖组织中的表达量最高;接种3 h后在根尖组织中的表达量开始升高,12 h最高,此时相对表达量约为3.1倍。【结论】CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调,表明该基因参与了抗性基因Me3介导的辣椒与根结线虫的不亲和互作,可能在此过程中具有重要功能。 相似文献
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草酸青霉菌I1的cDNA文库构建及其溶磷相关基因的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建草酸青霉菌I1的cDNA文库,筛选溶磷相关基因。【方法】利用SMART技术构建草酸青霉菌I1的初级cDNA文库,通过难溶磷培养基筛选具有溶磷能力的转化子,测序并进行生物信息学分析。在难溶磷液体培养基中,进行转化子对溶液pH值、可溶磷含量的影响和产有机酸试验。【结果】成功构建了草酸青霉菌I1的初级cDNA文库,其库容量约为5.29×106 cfu•mL-1,重组率为99%;利用难溶磷固体培养基筛选,得到具有溶磷圈的转化子48个,其中转化子I-4的cDNA序列全长536 bp,为一个新的序列,基因编码氨基酸残基序列长129 n.t。转化子E. coli HST08 I-4在液体难溶磷培养基中培养,提高了有机酸的表达量,并增加了有机酸的种类,在培养12 h后,开始产生乙酸,24 h后,溶液中产生乳酸、苹果酸和α-酮戊二酸,培养36 h,溶液pH值由6.32降到3.69,可溶磷含量达到0.1076 mg•mL-1。【结论】从草酸青霉I1中筛选到一个溶磷相关基因pstI。 相似文献