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1.
应用RT-PCR方法扩增牛脂联素(Bovine adiponectin,BovADPN)基因,连接到载体pMD18-T中;测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确,经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收目的基因片段,并将其定向克隆到pPICZαA载体中,构建重组质粒pPICZαA-BovADPN.用Sac Ⅰ酶切使其线性化,以化学方法(LiCl)转化入感受态毕赤酵母细胞GS115;重组子经高质量浓度Zeocin(1 000 mg/L)筛选、MDH/MMH平板筛选、PCR鉴定后,用1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot分析.结果表明,所获得的酵母重组子能够分泌表达出相对分子质量为40 000的重组蛋白. 相似文献
2.
应用PCR技术从含有罗曼鸡白介素18全长基因质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建了重组质粒pPICZαA-ChIL-18。经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达,并进一步分析了培养液pH值、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对重组菌表达水平的影响,从而获得最优化的表达条件。结果表明,重组毕赤酵母菌能够表达鸡IL-18,且在培养液pH6.0,甲醇诱导浓度1.5%,诱导温度26℃的条件下诱导96 h,目的蛋白的表达量最高,可占菌体总蛋白的60.2%。本文为鸡IL-18的规模化发酵生产奠定了基础。 相似文献
3.
为提高重组外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达,试验采用毕赤酵母(Pichia pastoris)偏嗜性密码子改变抗菌肽cyclopsychotride的碱基序列,通过SOEing法合成后连接到pPICZα-C质粒上,从而获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-cyclopsychotride,再通过限制性内切酶BlnⅠ线性化,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33中。结果表明:经PCR检测后及Zeocin抗性筛选,获得高拷贝转化子;通过琼脂孔穴扩散法检测,酵母表达上清液对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抑菌活性;抗菌肽cy-clopsychotride经沸水、酸碱及胃蛋白酶处理后仍具有抗菌活性。 相似文献
4.
根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法合成改造后的Cryptonin基因片段。基因克隆到pPICZα-C质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pPICZα-C-Cryptonin。pPICZα-C-Cryptonin通过限制性内切酶SacⅠ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞X-33内。PCR检测Cryptonin基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在AOX(醇氧化酶)启动子调控下,Cryptonin蛋白获得分泌表达,其相对分子质量约为2700。表达产物耐热性强,在100℃条件下10min内抗菌活性不变,煮沸30min以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示表达产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有很好的抑菌活性。 相似文献
5.
鹅源副黏病毒融合蛋白在毕赤酵母细胞中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出F蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pT-F。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pT-F,回收目的基因F片段,并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-F。用PmeⅠ酶切pPICZαA-F使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中。PCR法鉴定阳性重组子,10 mL/L甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果表明,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63 ku的重组蛋白,该重组蛋白可与NA-1株鹅源副黏病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应。 相似文献
6.
NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。 相似文献
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8.
通过DNA重组技术,将克隆到的MDPV-Q和MDPV-26的VP2基因片段,经两种限制性核酸内切酶SaclI和Kp-nl的酶切,将酶切产物再克隆到表达载体pPICZαA中,得到表达重组质粒pPICZαA-M-Q VP2和pPICZαA-M-26 VP2.将这两种表达重组质粒分别转化到毕赤酵母(Pichia Pastoris X-33)中进行表达,经甲醇诱导和SDS-PAGE分析结果表明,MDPV-QVP2和MDPV-26 VP2基因片段的表达产物大小约为73kD,与理论预计相符.此外,本研究还意外地发现,重组质粒转化到酵母菌进行表达,在表达VP2结构蛋白的同时,还表达了一条大小约为60kD的蛋白条带. 相似文献
9.
猪瘟是严重危害养猪业的一种烈性传染病,病死率高,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病。E2蛋白是猪瘟病毒中最主要的保护性抗原,因此,围绕E2的基因工程疫苗研究已成为热点。本研究以含有猪瘟E2基因的重组质粒pMD18-T-E2为模板,设计一对特异性引物扩增去除跨膜区的E2基因,将PCR产物插入巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-E2,将该质粒用SacⅠ酶切线性化后,电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X-33中,经Zeocin筛选得到高拷贝转化子,通过甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western bolt试验验证,结果表明E2蛋白在酵母中获得成功表达。 相似文献
10.
从国内分离的鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）众多流行株中获得超强毒株（vvIBDV）,应用RT-PCR方法,扩增得到IBDV主要保护性抗原VP2基因的开放编码框,克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA,将该重组质粒pPICZαA-VP2以电转化方法转入毕赤酵母X-33感受态细胞中,通过PCR鉴定、表型筛选和抗生素浓度梯度筛选,获得高拷贝阳性重组酵母菌株X-33-pPICZαA-VP2。经摇瓶诱导表达试验获得稳定高效分泌表达的酵母工程菌,表达量为0.459mg/ml,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）以及动物试验表明,重组酵母工程菌表达的目的蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物活性和免疫原性。 相似文献