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1.
参照GenBank中安哥斯牛杀菌/通透性增加蛋白(BPI)序列,设计合成1对引物.应用RT-PCR技术,从荷斯坦奶牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白N端,将该序列与原核表达载体pGEx-4T-1连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BPI.重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),用IPTG诱导表达.结果表明,获得了BPIN端长度为714bp的cDNA序列,序列分析证实在第503位出现了点突变.重组质粒诱导表达后,经SDS-PAGE电泳检测重组蛋白约在52 kD处出现特异性蛋白条带. 相似文献
2.
鸡、猪BPI氨基端的基因克隆和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了克隆杀菌/通透性增加蛋白(BP I)N端cDNA,构建重组体pM D 18-T-BP I,并进行序列鉴定,应用RT-PCR技术,参照G enB ank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PM N)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BP I)氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pM D 18-T连接,构建BP I氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定;从猪PM N的总mRNA中扩增出BP I氨基端48个氨基酸的基因片段,进行测序鉴定。获得鸡BP I N端长度为285 bp的基因片段。序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心;获得猪BP IN端长度为146 bp的基因片段。成功克隆出BP I N端基因,经序列测定,确认为BP I基因,为进一步表达该基因奠定了基础。 相似文献
3.
猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。 相似文献
4.
牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的两条互补的寡核苷酸链,退火后在5’端和3’端分别形成BamHI和XhoI位点的粘性末端。合成的LfcinB基因定向克隆到pET-32a原核表达载体,阳性克隆菌用TB培养基进行扩大培养,然后用终浓度1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示,LfcinB基因在大肠杆菌中获得了大量表达,表达蛋白以包涵体形式存在,利用TGE透析液对纯化的LfcinB重组蛋白包涵体进行了复性,复性的LfcinB重组蛋白的纯度为96.6%。 相似文献
5.
为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能,探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因,本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列,并将其克隆到pMD18-T simple载体,酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体,命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp1-N融合蛋白表达,并筛选最佳诱导条件,用谷胱甘肽Sepharose4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,牛Nramp1N端编码序列长186bp,与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异,致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1N端表达重组质粒pGEX-N2,于35℃、0.1mmol/LIPTG、诱导10h,在大肠杆菌中高效表达,表达产物的分子量为33kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。 相似文献
6.
通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF2扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF2(deleting ORF2)。将dORF2克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21细胞中成功地表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白GST-dORF2，表达量为22％。Westem-blot结果表明重组蛋白可被谷胱甘肽S-转移酶(GST)抗体识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV次要结构蛋白的结构和功能奠定了基础。 相似文献
7.
人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测 总被引：3，自引：0，他引：3
肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。 相似文献
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N端融合TAT穿膜肽的piggyBac转座酶的原核表达及其在HEK 293细胞中的功能验证 总被引：1，自引：0，他引：1
为了增加piggyBac(PB)转座系统在转基因操作中安全性和减少PB转座系统的辅助质粒带来的副作用,本研究利用N端融合人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽的原核表达PB转座酶替代辅助质粒在人肾胚细胞(HEK293细胞)介导PB转座的发生,同时建立一种由TAT介导的外源功能蛋白进入真核细胞的方法。构建了N端和C端分别融合TAT的PB转座酶原核表达载体(pET28A-Pbase 1,pET28A-Pbase 2)。利用pET28A-Pbase1载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达出N端含有TAT的PBase重组蛋白,纯化并对其进行蛋白定量,然后以100mg/mL的浓度加入细胞培养液中,转导进入HEK 293细胞,利用免疫荧光技术观察该酶能否进入HEK293细胞核,利用热不对称PCR(Tail-PCR)进行整合位点侧翼DNA序列检测,亚甲蓝进行阳性细胞克隆染色并利用非配对t检验统计细胞克隆数。聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定结果表明PBase在大肠杆菌中成功表达,经分析发现其主要以可溶蛋白形式存在。免疫荧光结果表明,N端融合TAT穿膜肽的PBase定位于细胞核,但是整合位点检测和转座效率统计结果表明,原核表达的PBase蛋白在HEK 293细胞中无法介导转座事件的发生。该转座系统能否在其他真核细胞中正常发挥作用,还需要进一步的研究。然而,本研究为由TAT穿膜肽介导的外源蛋白在真核细胞中的跨膜转运提供了一种可靠的方法。 相似文献
9.
根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒囊膜糖蛋白E2基因设计1对特异性引物,以Oregon CV24株为模板,PCR扩增目的片断后与pET-32a原核表达载体连接,转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,结果表明重组E2蛋白在体外得到较好表达,表达的融合蛋白分子量为57.7 ku。可溶性分析表明重组E2蛋白以包涵体的形式存在,经镍柱His标签蛋白纯化后进行western-blot检测。结果表明：E2重组蛋白均具有反应原性,能与BVDV的阳性血清进行反应。 相似文献
10.
猪传染性胃肠炎(swine transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,是我国法定检疫的疫病。为研究福建省猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)核衣壳蛋白基因(N)的分子特征及其原核表达产物的抗原性,参照GenBank中的TGEV全基因序列,设计合成一对扩增TGEV福建(FJ)分离株N基因的特异性引物,进行克隆和序列分析,结果表明,TGEV-FJ株N基因全长1149bp,编码382个氨基酸(GenBank登录号JQ700302),与国内外23株TGEVN基因的核苷酸同源性,氨基酸同源性进行比较分析,N基因核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。TGEV-FJ株N基因克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白约为68kD,与预期分子量一致;Western blot分析表明,重组蛋白能与抗TGEV阳性血清反应出现特异性条带;以纯化的重组TGEVN蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性,送检20份猪(Sus scrofa)TGEV阳性血清样本中检出16份阳性结果、10份阴性血清样本中检出9份阴性结果。利用纯化的TGEV重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了1株特异性好并能稳定分泌抗TGEVN蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1-27),间接免疫荧光试验证明,该单抗能特异性识别TGEV全病毒抗原。TGEVN蛋白的单克隆抗体制备为建立TGEV免疫学检测方法提供了基础资料。 相似文献
11.
重组鸡β-防御素5 - β-防御素10双分子蛋白的构建及其理化特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
鸡抗菌肽属禽β-防御素（AvBD）类,是鸡先天性免疫的重要组成部分。研究将AvBD10基因定向插入到AvBD5-pGEX SalⅠ和NotⅠ双酶切位点上,构建了AvBD5-pGEX- AvBD10双基因共表达重组载体。将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21,于37 ℃不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测外源基因的表达。结果表明,重组AvBD5-AvBD10双分子融合蛋白的分子量约为36 kD,重组双分子蛋白占菌体总蛋白的35%,重组菌表达产物以包涵体形式存在。重组双分子蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌[BL21(DE3-) 株]与致病性链球菌［Streptococcus（CAB株）］为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组双分子蛋白的抗菌活性,结果表明,重组双分子蛋白对这两种细菌都具有抗菌活性。并且对温度和pH有很高的稳定性,在-70～100 ℃或pH 3～12处理30 min仍具有抗菌活性。 相似文献
12.
郑喜邦 《农业生物技术学报》2008,16(5)
本研究的目的是构建牛Nanog基因原核表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导其表达。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增Nanog 基因,将其克隆到PMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片断,定向克隆到 pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG -Nanog ,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛Nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109, 在不同的培养温度和不同浓度的IPTG诱导下均获得了高效表达,说明培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western Blotting 检测证实该蛋白约60KD, 大小合适,具有GST抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog 蛋白。 相似文献
13.
利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。 相似文献
14.
根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。 相似文献
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在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因, 克隆至表达载体pET32a中, 构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化至感受态E. coli BL21(DE3) 中, 经IPTG诱导和SDS-PAGE 分析, 可见约42.4kDa 的目的蛋白以包涵体形式表达。Western blotting 分析发现, 表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中, 利用His•Bind试剂盒获得纯化的蛋白, 将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠, 间接ELISA法测得抗体的效价, MTT 法检测免疫小鼠的T 淋巴细胞增殖反应能力。结果说明该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。 相似文献
16.
参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。 相似文献
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将人工合成促性腺激素释放激素(GnRH)六聚体基因片段连接至pMAL-c4x载体,获得的pMAL-c4x-GnRH6重组质粒转化到大肠杆菌TB1中进行表达.采用SDS-PAGE,Western blot进行鉴定,并通过动物实验对表达产物的免疫原性进行检测.获得了分子量大小约为50 kD的麦芽糖结合蛋白-GnRH六聚体(MBP-GnRH6),且融合蛋白与GnRH抗体的反应性较好,并能使睾丸萎缩、变性.表明重组MBP-GnRH6融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,可用于小鼠的免疫去势. 相似文献
18.
用一段45个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗体重链和轻链可变区基因片段VH和VL,获得了抗对硫磷单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,构建了抗对硫磷scFv基因原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot分析显示,该单链抗体基因能在大肠杆菌Origami 2中特异性表达,融合蛋白分子量约为28kD。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,得到目的蛋白纯度为74.8%;ELISA反应结果证明,该单链抗体可以与对硫磷发生特异性反应。 相似文献