共查询到18条相似文献，搜索用时 203 毫秒
1.
[目的与方法]以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tams1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD<,450>≥0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15;.Tams1间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与环形泰勒虫病巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]建立的Tams1间接ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法,为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段. 相似文献
2.
牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exon)融合蛋白间接ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的与方法]以纯化的牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(exons) 融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了检测牛双芽巴贝斯虫血清特异性抗体的新型间接ELISA方法.[结果]方阵试验确定的GST-HSP20抗原的最适包被浓度为5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为40倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.292,批内和批间重复试验的变异系数均小于10;.HSP20间接ELISA方法能排除GST的干扰,与其它梨形虫病无交叉反应,与巢式PCR检测方法的阳性符合率为96;.[结论]所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高.这是国内首次利用重组蛋白建立的牛双芽巴贝斯病血清学诊断方法,为大规模地进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段. 相似文献
3.
[目的]建立检测猪蛔虫抗体的间接ELISA方法。[方法]用猪蛔虫重组ASl6蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定试验确定ELISA的最佳工作条件,包括抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度、最佳包被液、抗原封闭时间、血清反应时间、酶标二抗工作时间和间接EusA判定标准,并通过交叉试验现场对1200份猪血清样本采用该试验建立的EusA和AGP同时进行蛔虫抗体的检测。[结果]ELISA的最佳工作条件是：抗原包被浓度为10μg／ml,37℃1h,4℃过夜;血清稀释度为1：80;酶标SPA稀释度为1：t0000,37℃孵育45min。该试验制备的ELISA酶标板的临界值为0．196。交叉试验检测表明,ELISA方法阳性检出率为45％,而AGP阳性检出率为30％。该方法具有特异高、快速、敏感等特点。[结论]研究结果证实重组ASl6蛋白具有良好的反应原性,可以用来建立ELISA方法诊断猪蛔虫病。 相似文献
4.
[目的]为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法.[方法]重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达; Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集的纯培养物进行超声波裂解后以His bind kit蛋白质纯化试剂盒纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度.[结果]重组蛋白表达可达菌体蛋白总量的19.7;,且具有较好的反应原性和特异性,以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约43头份血清样品进行检测, 检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93.55;.[结论]以BVDV E2重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA检测方法是可行的,为其进一步的标准化莫定基础. 相似文献
5.
旨在原核表达Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的Hexon蛋白,并以Hexon蛋白为包被抗原建立血清的间接ELISA检测方法。将FAVⅠ群Hexon基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组Hexon蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Westernblot鉴定;纯化后的Hexon蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清的间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果表明,原核表达获得大小约为37.4ku的重组Hexon蛋白;Westernblot结果表明重组蛋白有良好的特异性和抗原反应性。FAVⅠ间接ELISA法优化反应条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0mg/L,封闭条件为37℃作用1h,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.322为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明,对鸡新城疫、禽流感、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对阳性血清的敏感性可达1∶1 200,70份阳性血清的阳性率为97.1%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别为1.2%~3.5%和5.1%~8.3%;用此方法对临床279份鸡血清样品检测的阳性率为51.3%。表明建立的ELISA检测方法可用于FAVⅠ抗体水平的检测。 相似文献
6.
【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15min。7S抗原蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间25min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好,灵敏度较高。【结论】建立了仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法,该法具有很强的特异性和敏感性,可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。 相似文献
7.
【目的】原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的N蛋白,并以N蛋白为包被抗原建立血清间接ELISA检测方法。【方法】克隆PPRV N蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中进行重组N蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化复性,并进行Western-blot鉴定。用复性后的N蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清中PPRV抗体水平的间接ELISA检测方法,并对其进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后用该方法对临床样品进行检测,检验其应用效果。【结果】原核表达获得大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot分析表明重组蛋白具有良好的特异性和反应原性。PPRV间接ELISA法优化反应条件为:抗原包被量每孔400ng,血清以1∶200倍稀释作用2h,酶标二抗以1∶8 000倍稀释作用1h,TMB显色时间20min,在该优化条件下,OD450≥0.309为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,该条件下对羊痘、羊口疮、羊布氏杆菌和羊魏氏梭菌血清检测结果均为阴性;对80份阳性血清进行检测,敏感性为98.7%。重复性试验表明,批内和批间OD450值的变异系数分别在2.29%~8.65%和2.13%~5.68%。用本试验建立的ELISA检测体系对临床197份血清进行检测,阳性率为85.79%,与标准试剂盒的符合率为96.4%。【结论】建立的ELISA检测方法可用于PPRV抗体水平的有效检测。 相似文献
8.
《福建农业学报》2015,(11)
对禽坦布苏病毒非结构蛋白NS1基因进行原核表达,并进行生物学活性鉴定。将表达成功具有生物学活性的重组蛋白经纯化后,作为抗原包被ELISA平板,通过条件优化,建立检测禽坦布苏病毒血清学检测方法。结果表明,表达的NS1重组蛋白大小约为60kd,该蛋白经Western blot检测具有良好的生物学活性。将该重组蛋白纯化后包被ELISA板建立检测禽坦布苏病毒血清学间接ELISA方法,该方法优化后的参数为2.5μg·mL~(-1)包被ELISA板;一抗(鸭血清)血清稀释度为1∶100;酶标二抗为1∶3 000。本研究建立的方法特异性强,批内和批间重复性较好。用建立的间接ELISA方法对坦布苏病毒灭活苗免疫鸭血清和自然感染鸭血清进行检测,结果表明,本研究建立的NS1-ELISA不能用于区分禽坦布苏自然感染和疫苗免疫血清的鉴别诊断。 相似文献
9.
以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法。方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5μg／mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10％。经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。 相似文献
10.
以纯化的牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测牛巴贝斯虫血清特异性抗体的间接ELISA方法.方阵试验确定的GST-MSA-2C抗原的最适包被浓度为2.5 μg/mL,血清最佳稀释倍数为20倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450≥0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%.经对多例血清检测表明,所建ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高. 相似文献
11.
[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接 ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a（＋）,构建重组质粒 pET-ApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌 BL21（DE3）中进行表达。通过 Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪 APP抗体的间接 ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经 PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被 APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测 APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化 ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。 相似文献
12.
13.
[目的]为孕酮检测试剂盒的研制奠定基础。[方法]采用二环己基碳化二亚胺法制备检测抗原,建立了检测奶牛孕酮含量的间接竞争ELISA方法。[结果]检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA的最佳反应条件确定为:最佳包被浓度为100 ng/ml,碳酸盐缓冲液的包被效果较好,以4℃过夜+37℃2 h佳,最佳封闭液为2%山羊血清,酶标抗体的工作浓度为0.13μg/ml。建立的标准曲线方程为y=-1.844 4x-0.140 1(R2=0.981 7),检测范围为0~20 ng/ml,最低检测限为0.58 ng/ml。该标准曲线的批内变异系数和批间变异系数分别为2.22%和2.37%。[结论]该研究建立了定量检测奶牛孕酮的间接竞争ELISA方法。 相似文献
14.
将鸡白细胞介素18的成熟蛋白(chicken interleukin 18 mature protein,mChIL-18)基因在原核系统表达,采用Ni-NTA亲和层析方法纯化得到该重组蛋白。纯化后重组蛋白包被反应板,通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、羊抗鼠酶标二抗稀释倍数,建立检测ChIL-18成熟蛋白抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定结果确定最佳抗原包被质量浓度为4μg/ml,阳性血清稀释比例为1∶104,羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释比例为1∶12 000,抗原抗体最佳结合时间是1.5 h,血清与二抗最适反应时间为1 h。阴性、阳性血清的判定标准为:被检样本的OD值是一组阴性样本OD值的2或3倍且OD450≥0.5,即为阳性,比值以P/N表示1,.5P/N2.0为可疑,P/N1.5为阴性。本试验结果证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,为下一步单抗的筛选鉴定奠定了必要的基础。 相似文献
15.
【目的】建立一种鉴别I群禽腺病毒（FAVI）灭活苗免疫和野毒感染的检测方法,为FAVI的防控与净化提供技术支撑。【方法】以FAVI 33K重组蛋白为包被抗原,筛选和优化间接ELISA的条件,建立FAVI抗体的间接33K-ELISA检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,并鉴别检测FAVI活病毒感染血清和灭活苗免疫血清各50份。【结果】33K重组抗原最佳包被浓度6.0 μg/mL,包被条件为37℃孵育1 h后4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶,封闭时间1.0 h;待检血清稀释度1∶100,抗原抗体最佳作用时间1.0 h;酶标二抗最佳稀释度1∶3000,作用时间45 min。优化后的间接33K-ELISA的阴、阳性临界值为0.316。其特异性、敏感性、重复性试验及鉴别检测结果表明,优化后的间接33K-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,且能成功鉴别FAVI感染与灭活疫苗接种。【结论】间接33K-ELISA操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、适于批量检测,可有效鉴别FAVI感染和灭活苗免疫接种,利于挑选出FAVI感染动物,为FAVI的防控与净化提供了新思路和新方法。 相似文献
16.
[目的]利用纯化的刚地弓形虫RH株表面蛋白SAG3的原核重组蛋白为基础,建立抗体间接ELISA检测方法。[方法]采用棋盘滴定法,确定间接ELISA的最佳条件。采用鼠抗新孢子虫阳性血清、鼠抗安氏隐孢子虫阳性血清、鼠抗柔嫩艾美尔球虫阳性血清、鼠抗蓝氏贾第虫阳性血清以及鼠抗微小隐孢子虫阳性血清和健康小鼠阴性血清作对照,检测血清之间是否有交叉反应。[结果]最佳包被条件为:抗原包被浓度0.25μg/孔,被检血清稀释度1∶400,酶标二抗稀释度1∶3 000,封闭剂5%脱脂奶粉的PBST溶液;血清之间没有交叉反应。该方法的灵敏度为1∶1 600。[结论]该方法灵敏度高,特异性较强,可重复性较好,可用于对弓形虫感染的检测及流行病学调查。 相似文献
17.
以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:σB蛋白包被浓度为12.5μg·mL~(-1);σC蛋白包被浓度为6.25μg·mL~(-1);封闭液为15%FBS;血清稀释度为1∶80;酶标二抗稀释度为1∶400;底物37℃显色5min。该方法对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法与NDRV全病毒间接ELISA相比较,符合率高达92.5%。本研究进一步丰富了NDRV抗体的检测方法。 相似文献
18.
利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法。克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定产物。以纯化重组CbpB蛋白作为包被抗原,通过一系列反应条件优化,建立检测ER抗体的间接ELISA方法(CbpB-ELISA),并用于临床猪血清样品检测。建立该方法的最适条件:包被抗原浓度为1.0 μg·mL-1,4 ℃过夜;5%脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h;血清稀释度为1:100,37 ℃孵育60 min;酶标二抗稀释度为1∶1 000,37 ℃作用45 min;显色时间为37 ℃作用10 min。该方法可特异性地检测ER抗体,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应性;阳性血清稀释至1:12 800时仍可检出;批内及批间变异系数均小于10.00%;与全菌体-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western-blot比较,该方法总符合率分别为91.67%、93.33%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为92.45%、94.55%、88.89%、90.91%,阴性符合率分别为85.71%、80.00%、66.67%、80.00%。对进行和未进行ER免疫的猪血清样品检测,免疫抗体阳性率为86.67%,感染抗体阳性率为30.50%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为ER的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。 相似文献