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1.
首先获得绵羊胎儿成纤维细胞、成年耳组织成纤维细胞及前脂肪细胞,用脂质体介导法、BTX电转法及Nucleofector核转法对上述细胞系转染绿色荧光蛋白(gfp)基因,并对转染效率进行比较,最后探讨3种转gfp基因细胞对绵羊转基克隆胚发育的影响。结果:核转法的转基因效率最高,3种细胞的转基因效率分别为86%,87%和90%,显著高于BTX电转法和脂质体法基因转染效率;脂质体转染效率显著低于BTX电转效率(P<0.05)。而对同一种转染方法而言,基因转染效率在3种细胞间差异均不显著(P>0.05)。在以上述3种转基因细胞为核供体的转基因克隆试验中,胚胎融合率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),胎儿成纤维细胞组的囊胚率显著高于前脂肪细胞组(P<0.05),但耳组织成纤维细胞组与胎儿成纤维细胞、前脂肪细胞间差异均不显著(P>0.05)。结果表明核转法基因转染效率最高,胎儿成纤维细胞最适合于胚胎克隆研究。 相似文献
2.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(19)
Oct4(POU5f1)是诱导重编程的关键性因子,为检测克隆获得的绵羊Oct4基因启动子的表达活性,本研究将前期工作中克隆获得的绵羊Oct4基因启动子与携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的p Ac GFP1-N1载体相连接,构建由Oct4启动子驱动的真核表达载体(SPOct4-p Ac GFP1-N1),并采用脂质体转染法,分别转染小鼠和绵羊成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎,以检测其表达活性。结果表明:Oct4启动子序列含有Sp1结合位点和CAAT框等功能区;转染后,小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎中检测到绿色荧光,并且在转染72 h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中未能观察到GFP的表达。说明由克隆获得的Oct4基因启动子驱动的真核表达载体具有在多能干细胞中特异的表达活性。 相似文献
3.
为了获得具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能力的绵羊胎儿成纤维细胞,采用组织块和酶消化法分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,利用脂质体转染法将shRNA转基因表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,经抗性筛选获得抗性细胞克隆,利用PCR方法对获得的细胞克隆进行鉴定,用BVDV侵染转基因细胞,利用real-time PCR和病毒滴定测定法分析不同细胞克隆抑制BVDV复制的能力。结果显示:试验成功构建了靶向BVDV表达shRNA的转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-sh BVDV,经抗性筛选共获得22个抗性细胞克隆;22个细胞克隆中12个细胞克隆含有目的基因,为转基因细胞,其中5个转基因细胞克隆具有明显的抗BVDV复制的能力,最高抗病毒效率达到90.7%。结论:在细胞水平能有效抑制BVDV病毒增殖的转基因绵羊胚胎成纤维细胞的获得,为进一步利用体细胞核移植技术制备转基因绵羊提供了合适的供体细胞。 相似文献
4.
《中国兽医杂志》2017,(6)
本试验采用组织块贴壁法对初生仔猪的耳组织进行原代培养,成功分离出转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞,并对细胞进行形态学观察,冻存前和复苏后细胞活力检测,生长动力学分析,波形蛋白免疫组化,染色体计数以及微生物污染检测等生物学特性分析。结果表明,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,7组细胞冻存前细胞活力均在为92%以上,冻存3个月后细胞复苏活力仍在89%以上;细胞生长总趋势呈"S"型,即经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白免疫组化在成纤维细胞中呈阳性反应;染色体计数结果表明,染色体数量稳定;成纤维细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。本试验成功建立了转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系。 相似文献
5.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(1)
为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞后,观察其在两种细胞中的表达活性。结果表明:利用克隆获得的5OV构建的真核表达载体p Ac GFP1-5OV在转染鸡输卵管上皮细胞后第24小时,在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光,而转染鸡成纤维细胞后未观察到GFP表达。说明所克隆的5OV具有在输卵管上皮细胞特异表达的活性。 相似文献
6.
利用脂质体转染法获得转Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)基因的成纤维细胞,将其作为供体细胞,再通过体细胞核移植技术构建重构胚,最终生产出转TLR4基因且性别可控的大尾寒羊。本研究通过原代培养大尾寒羊胎儿皮肤成纤维细胞,并进行SRY基因性别鉴定,利用脂质体转染法转入TLR4基因,然后分别从形态学与分子水平检测TLR4基因的表达,将稳定表达转TLR4的成纤维细胞核移植入绵羊去核卵母细胞中构建重构胚。最终获得5个稳定表达TLR4的阳性细胞克隆,经SRY基因性别鉴定为雌性细胞株,通过实时荧光定量PCR分析,在第4代转染的细胞中TLR4表达量最高,比未转染细胞高出7.4816倍(P<0.01),卵裂的重构胚中有EGFP的表达。试验成功构建出含TLR4基因的重构胚,为今后生产出性别可控的抗病转基因绵羊地方新品种奠定基础。 相似文献
7.
《中国畜牧兽医》2020,(1)
试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID_(50)法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数(MOI)值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率(%)。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3～4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×10~(11) PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。 相似文献
8.
试验旨在探究利用携带标记基因增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的腺病毒载体转染入水貂耳缘成纤维细胞的可行性及感染效率。首先利用组织贴壁法分离培养水貂原代耳缘成纤维细胞并进行传代,然后包装病毒Ad-EGFP并使用TCID50法进行滴度检测,设置两组不同浓度梯度的病毒液感染水貂耳缘成纤维细胞,感染复数（MOI）值分别为0/100/300/500/700/900和0/10/30/50/70/90,通过在显微镜下观察阳性细胞占总细胞数的比值估计转染效率（%）。结果表明,组织贴壁法培养水貂耳皮肤组织11 d可长满原代细胞,传代细胞在3~4 d融合度可达80%左右,包装Ad-EGFP病毒滴度为1.99×1011 PFU/mL,用其感染水貂成纤维细胞最佳MOI值为30,瞬时转染效率可达90%以上。综上,利用腺病毒载体转染水貂成纤维细胞具有可行性,是一种高效的转染方式,为后续水貂基因组编辑前期验证试验奠定基础。 相似文献
9.
永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系的建立 《畜牧与饲料科学》2021,42(3):1-6
[目的]建立永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系,为基础研究和动物病毒的研究提供稳定的体外细胞模型。[方法]采用组织块贴壁法培养绵羊瘤胃成纤维细胞（ovine ruminal fibroblasts cells,ORFCs）,利用PEI试剂将带有hTERT基因的pCI-neo-hTERT质粒转染ORFCs,经G418筛选得到阳性克隆细胞。采用RT-PCR、Western Blot检测F15和F35代阳性克隆细胞的hTERT基因的转录和表达情况;利用血球计数法绘制原代ORFCs和F35代阳性克隆细胞的生长曲线比较其增殖能力。[结果]将hTERT基因成功转入ORFCs并稳定表达;阳性克隆细胞的增殖能力显著高于原代ORFCs。[结论]该试验成功建立了永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2017,(7):1316-1321
通过比对人、鼠、兔和牛的Nanog启动子保守区设计引物,PCR扩增绵羊Nanog基因启动子序列并分析其调控位点。将其连接到去掉自身CMV启动子的pAcGFP1-N1载体上,构建一个由Nanog启动子带动的真核表达载体(SNanog-pAcGFP1-N1),即构建一个能由该启动子序列带动并产生绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,并用脂质体法转染入终末分化细胞(小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞)、胚胎干细胞和小鼠胚胎,检测其表达活性。结果显示:成功克隆出1 836bp Nanog启动子序列,通过分析发现该序列含有SP1结合位点、CAAT框、TATA框等功能区;当转染SNanog-pAcGFP1-N1重组质粒后,小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞中能检测到绿色荧光,且在转染72h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中不能观察到GFP。结果表明:本试验成功克隆获得绵羊Nanog启动子,所构建的真核表达载体具有在多能干细胞中特异性表达活性。 相似文献
11.
为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染.克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体.用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24 h后观察荧光表达,48 h后加入600μg·mL-1 G418,筛选1周,300 p.g·mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养.对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析.结果,转染24 h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEGFP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1500 bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体.说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性.可以作为核移植进行转基因克隆牛研究. 相似文献
12.
研究采用 1 4～ 1 8d兔胎儿的生殖嵴及周围组织与其同源成纤维细胞共培养 ,低糖DMEM +1 0 %NBS +1 0 %FCS +1 0ng/mLLIF +1 0ng/mLSCF+0 1mol/Lβ 巯基乙醇 +1 0 0U/mL青霉素 +80U/mL链霉素作培养基 ,分离出兔原始生殖细胞 (PGC) ,克隆并多次传代。从原始生殖细胞 (PGC)中获得胚胎生殖细胞 (EG)细胞集落 ,1 4d胎儿原代观察到类EG细胞集落 ,传至 4代后丢失。 1 6d胎儿的类EG只传 2代 ,1 8d胎儿没有得到EG细胞集落。EG细胞具有干细胞的诸多特征 ,呈典型的团块状聚集生长 ,碱性磷酸酶 (AKP)染色呈阳性 ,在衰老饲养层的培养基中生长形成类胚体、上皮细胞、神经细胞和成纤维细胞等 相似文献
13.
Cho J Bhuiyan MM Shin S Park E Jang G Kang S Lee B Hwang W 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2004,66(12):1567-1573
The present study was conducted to establish an efficient production system for bovine transgenic somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos, the effect of various conditions of donor cells including cell type, size, and passage number on the developmental competence of transgenic SCNT embryos were examined with their expression rates of a marker gene. An expression plasmid for human prourokinase was constructed by inserting a bovine beta-casein promoter, a green fluorescent protein (GFP) marker gene, and a human prourokinase target gene into a pcDNA3 plasmid. Three types of bovine somatic cells including two adult cells (cumulus cells and ear fibroblasts) and fetal fibroblasts were prepared and transfected with the expression plasmid using a liposomal transfection reagent, Fugene6, as a carrier. In Experiment 1, three types of bovine cells were transfected at passages 2 to 4, and then trypsinized and GFP-expressing cells were randomly selected and used for SCNT. Developmental competence and rates of GFP expression in bovine transgenic SCNT embryos reconstructed with cumulus cells were significantly higher than those from fetal and ear fibroblasts. In all cell types used, GFP expression rates of SCNT embryos gradually decreased with the progression of embryo development. In Experiment 2, the effect of passage number of cumulus cells in early (2 to 4) and late (8 to 12) passages was investigated. No significant differences in the development of transgenic SCNT embryos were observed, but significantly higher GFP expression was shown in blastocysts reconstructed with cumulus cells at early passage. In Experiment 3, different sizes of GFP-expressing transfected cumulus cells [large (>30 microm) or small cell (<30 microm)] at passages 2 to 4 were used for SCNT. A significant improvement in embryo development and GFP expression was observed when small cumulus cells were used for SCNT. Taken together, these results demonstrate that (1) adult somatic cells as well as fetal cells could serve as donor cells in transgenic SCNT embryo production and cumulus cells with small size at early passage were the optimal cell type, and (2) transgenic SCNT embryos derived from adult somatic cells have embryonic development potential. 相似文献
14.
猪前脂肪细胞为核供体生产表达绿色荧光蛋白的转基因克隆胚胎 总被引：1，自引：0，他引：1
分离培养了成年猪前脂肪原代细胞，并对前脂肪细胞向成熟脂肪细胞进行诱导分化，油红O染色法鉴定了脂肪细胞。利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP—N1转染前脂肪细胞，经过G418筛选获得了阳性细胞株。然后分别以前脂肪细胞、转绿色荧光蛋白（GFP）前脂肪细胞及胎儿成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植，结果表明：前脂肪细胞（8．8％）和胎儿成纤维细胞（8．3％）的囊胚发育率无显差异著（P〉0．05）；与前脂肪细胞相比，转基因前脂肪细胞的囊胚发育率降低，但差异不显著（3．7％ vs．8．8％，P〉0．05）。前脂肪细胞为核供体生产转基因克隆胚胎，能够获得转基因囊胚。虽然囊胚发育率不高，但为生产脂肪细胞转基因克隆猪奠定了基础。 相似文献
15.
C.H. Campbell 《Veterinary microbiology》1979,4(1):1-10
Two uncloned populations of foot-and-mouth disease virus, one pathogenic for adult mice and the other nonpathogenic, were passaged in cultures of primary bovine kidney (BK) cells and a line of pig kidney (MVPK) cells. Within 10 passages in MVPK cells, the nonpathogenic virus became pathogenic for adult mice, but similar passages of this virus in BK cells did not affect its pathogenicity. In contrast, passage of the pathogenic virus in MVPK cells resulted in a decrease in pathogenicity, but again passage in BK cells had no effect on this characteristics. Neither of the viruses changed in pathogenicity for infant mice during the four passages that were tested. The nonpathogenic virus passaged in BK cells was more infectious for BK than for MVPK cells, but after passage in MVPK cells, this virus was about equally infectious for the two types of cells. Infectivity of the pathogenic virus was relatively unchanged by passage in either type of cell. The parent nonpathogenic virus and the 10th BK cell passage of this virus were much more resistant to adsorption with homogenized mouse kidney than were the MVPK cell passages of nonpathogenic virus. The parent and passaged pathogenic viruses were readily adsorbed. The results demonstrated that passage of the two viruses in MVPK cells had a pronounced selective effect. 相似文献
16.
猪乳腺细胞分离培养及EGFP基因转化 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞.利用乳腺细胞堵养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞.结果,从成年猪乳腺组织中成功分离培养出上皮细胞和成纤维细胞,获得转EGFP基因上皮细胞和成纤维细胞.上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚,比较明显.成纤维细胞呈长梭形.结果表明,可以从猪乳腺组织中分离上皮细胞和成纤维细胞,EGFP可以在这些细胞中表达. 相似文献
17.
表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性 总被引：4，自引：0，他引：4
将表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1．7kb外源基因片段，酶切位点与原始代次相同；各代次外源基因序列与原始序列相比，仅有1个碱基发生变化，不涉及氨基酸的变化；免疫荧光试验显示各代次均有显著表达；各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价(log2)逐渐上升；攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。结果表明：此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未见变化，免疫保护效力亦与原代一致。 相似文献
18.
从胚胎发育阶段、饲养层和培养体系等方面对影响绵羊类ES细胞分离、克隆效率的因素进行探讨。结果显示：致密桑葚胚和囊胚的ICM增殖率高于囊胚和孵化囊胚。绵羊类ES细胞在同源绵羊胎儿成纤维细胞（SEF）上生长比较缓慢,最终传代次数也低于小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）组。培养液中同时添加胎牛血清（FBS）和Knock-out血清替代品（KSR）,绵羊类ES传至7代,添加了碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）后,最高可传至8代,而单纯添加KSR或FBS,分别传至4代和5代。对类ES细胞进行AKP染色、核型分析、体外分化试验,证实分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且表达多潜能性细胞因子Nanog。由此认为,致密桑葚胚和囊胚更适合绵羊类ES细胞的体外分离和培养,而且MEF更适合于绵羊类ES细胞的分离传代,培养液中添加5%FBS和15%KSR,比较适合类ES细胞的分离传代,bFGF对绵羊类ES细胞的增殖具有促进作用。 相似文献
19.
Golla K Selokar NL Saini M Chauhan MS Manik RS Palta P Singla SK 《Reproduction in domestic animals》2012,47(5):842-848
Somatic cells in milk are a potential source of nuclei for nuclear transfer to produce genetically identical animals; this is especially important in animals that are susceptible to risks of bacterial infection on biopsy collection. In this study, a minimum of 10 milk samples were collected from each of the three buffaloes representing Murrah breed. All the samples were processed immediately and cell colonies were obtained. Cell colonies from one buffalo (MU-442) survived beyond 10 passages and were evaluated by fluorescence microscopy and used in nuclear transfer experiments. In culture, these cells expressed vimentin, indicating they were of fibroblast origin similar to ear cells. We compared the effectiveness of cloning using those milk-derived fibroblast (MDF) cells and fibroblast cells derived from the ear derived fibroblast (EDF). Fusion and cleavage rates of MDF-NT and EDF-NT embryos were found to be similar (92.43 ± 1.28% vs 94.98 ± 1.24%, and 80.27 ± 1.75% vs 84.56 ± 3.73%, respectively; p > 0.01); however, development to blastocyst stage and total cell number was higher for EDF-NT embryos (50.24 ± 2.54%, 227.14 ± 13.04, respectively, p < 0.01), than for MDF-NT embryos (16.44 ± 0.75%, 170.57 ± 4.50 respectively). We conclude that somatic cells from milk can be cultured effectively and used as nucleus donor to produce cloned blastocyst-stage embryos. 相似文献