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伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。 相似文献
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伪狂犬病病毒鄂A株 TK－／LacZ＋突变株的构建 总被引：4，自引：1，他引：3
本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI／KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5.9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI／KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点，构建转移质粒pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待完全病变后在X-gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK 相似文献
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表达绿色荧光蛋白为伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性 总被引：5，自引：1，他引：4
对含伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株gG全基因，PK，gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造，肖除其中的EcoRI位点，将通过PCR扩增的增强绿色 荧光蛋白基因（EGFP）融合到gG启动子下游，构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG^-1/EGFP^ ，该转移载体单独转染或同PVR基因组DNA共转梁IBRS－2细胞，结果单独转染时EGFP不能表达，共转梁时，6h就可在荧光显微镜下观测到明显的荧光。 相似文献
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《中国兽医学报》2020,(2)
根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。 相似文献
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伪狂犬病病毒Bartha株TK-/LacZ+突变株的构建及其生物学特性研究 总被引：3，自引：1，他引：2
本研究将伪狂犬病病毒Bartha株基因组与含有LacZ标志基因的TK基因转移质料pUEKPZ共转染猪肾传代细胞PK－5，细胞出现病变后，反复冻融3次收毒，按1：5稀释接种于IBRS－2细胞。在X－gal存在下挑取蓝斑，蓝斑筛选3次，再进行空斑试验，同时用PCR扩增LacZ基因，经3次空斑纯化，随机挑取的空斑均能扩增出LacZ基因，证实所获得的重组病毒为伪狂犬病病毒Bartha株TK^-/LacZ^ 突变株。TCID50试验表明，TK失活对Bartha株在细胞上增殖无影响；Balb/C小鼠试验表明，该突变对Balb/C小鼠的安全性明显高于Bartha亲本毒株。 相似文献
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为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研... 相似文献
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伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。 相似文献
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猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救 总被引：3，自引：0，他引：3
采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具. 相似文献
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为探寻伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）基因缺失株rPRV-bc-8基因组UL4-UL3基因间区域是否可作为外源基因的插入位点，在实验室已构建的含有增强型绿色荧光蛋白（Enhance Green fluorescent protein，EGFP）基因的转移质粒pMD-US6+7-EGFP-US2的基础上，通过DNA体外分子克隆技术将UL4序列替换左同源臂US6+7序列，UL3序列替换右同源臂US2序列，并将PolyA引入转移质粒，得到转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3。利用脂质体转染法将转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8共转染PK-15细胞，经蚀斑纯化成功得到一株能够稳定表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。通过倒置荧光显微镜观察以及PCR鉴定确定EGFP基因已成功插入到伪狂犬基因组的UL4-UL3之间，并通过细胞传代试验分析得到重组毒的遗传稳定性良好。通过体外增殖试验分析得到重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快，接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8，接种后40 h达到最高滴度108.3 TCID50/mL，与亲本毒的最高滴度接近，但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒，并且在达到平台期后病毒滴度下降的比亲本毒快。通过对病毒培养液中荧光蛋白浓度进行测定，结果显示在接种后56 h时荧光蛋白浓度达到最高值4793.9 ng/mL，之后进入平台期。综上结果表明构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力，并且外源基因EGFP在此位点具有良好的表达效果，为进一步相关重组病毒的构建奠定了基础。 相似文献
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伪狂犬病病毒Fa株gD基因的克隆及序列分析 总被引：3，自引：0，他引：3
本研究从含有伪狂犬病病毒(Pseudorabies
virus，PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒pSKgDSB和pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残基水平上也有差异。 相似文献
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为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础 相似文献
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为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒,采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测,并将病料接种至PK-15细胞分离病毒,以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明,PCR检测结果 PRV阳性,病料接种PK-15细胞24h后,细胞开始出现细胞病变;将病毒感染小鼠,36h后小鼠出现局部奇痒、死亡;gD基因序列分析发现,分离毒株与GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98%以上,氨基酸同源性在99%以上;在分离毒株gD基因的808bp~837bp位置上存在缺失与变异、高变重复区。本研究成功分离获得一株羊源伪狂犬病毒,为云南省羊伪狂犬病防控和基础研究提供资料。 相似文献
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猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗的制备及安全性与免疫性试验 总被引：12，自引：0，他引：12
用本室分离鉴定的猪伪狂犬病毒鄂A经毒株接种仓鼠肾细胞（BHK－21）,制备病毒抗原液，毒价不低于10^-6TCID50/0.1ml。经一定浓度的甲醛溶液灭活后与油相佐剂乳化研制成油乳剂灭活油疫苗4批。本研究对该制品的安全性、免疫性进行了测定。对18g左右小白鼠接种0.3ml，初生仔猪、断奶仔猪及妊娠母猪加倍剂量注射，均未出现不良反应，安全性良好。对母猪的繁殖性能不产生影响。后备母猪及妊娠母清中和抗体指数于免疫后21d达到316以上，间隔35d加强免疫一次后，中和抗体指数可达1000以上。断奶仔猪及初生仔猪免疫后对强毒的攻击，保护率分别为100％及90.62％。 相似文献
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本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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为研究猪肾细胞系PK-15中Beta 2微球蛋白（Beta 2 microglobulin，β2m）基因的表达情况，提取细胞总RNA，经RT-PCR扩增β2m。回收后的基因克隆至pMD18-T载体，获得重组质粒，经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切筛选后，阳性克隆送生物公司测序。序列经GENETYX version 9.0编辑分析，通过DNAMAN version 5.2.2与其他猪β2m基因进行序列比对分析，利用Mega 5.0的NJ法进一步分析其与其他物种β2m的分子进化关系，并在此基础上利用SWISS-MODEL和PDBsum预测该基因编码的成熟肽二级结构和三级结构。提取PK-15总蛋白，Western blotting检测和分析细胞中β2m的表达。结果显示，经RT-PCR扩增，成功获得β2m条带，大小约360 bp。经测序发现PK-15-β2m基因为364 bp，共编码118个氨基酸，其中成熟肽为98个氨基酸，N端信号肽含有20个氨基酸。序列分析证实PK-15细胞中β2m基因未发生突变；分子进化分析显示，PK-15-β2m与牛的亲缘关系最近，其次为羊、马等。多重序列比对发现，PK-15-β2m与牛、羊、马β2m成熟肽均为98个氨基酸，而其他物种β2m成熟肽为99个氨基酸；二级结构预测显示，PK-15-β2m成熟肽主要以β-折叠、β-转角和γ-转角为主，不含有α-螺旋。三级结构预测显示，PK-15-β2m成熟肽主要由7条β-折叠条带构成。Western blotting分析显示β2m在细胞中成功表达。本研究证实了猪肾细胞系PK-15中β2m在核酸和蛋白质水平均稳定表达，为下一步研究PK-15细胞的抗原递呈功能奠定了基础。 相似文献
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凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定。结果表明：两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。 相似文献
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猪ESR基因一个外显子片段的克隆与序列分析 总被引：10，自引：0，他引：10
参考人、鸡、鼠的ESR基因序列，设计一对引物，采用PCR技术扩增出猪ESR基因一段DNA片段，将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR扩增和酶切分析进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。将测定的猪ESR基因的部分序列（332bp)与人、鼠、鸡的序列进行比较，结果表明：猪的核苷酸和氨基酸序列与人、鼠、鸡相比，同源性分别为90．06％和86．36％，85．54％和88．18％，74．10％和71．82％，显示了强的保守性，猪的核苷酸序列与人、鼠、鸡相比存在着4处特有变异，氨基酸序列aa25-30存在高变异区。 相似文献
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乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建 总被引：7，自引：0，他引：7
设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中，获得重组中间转移质粒pUSK—NS1。将pUSK—NS1与伪狂犬病毒Ea株TK／gG／LacZ^ 突变株基因组共转染真核细胞IBRS-2，通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK／gG^-／NS^ 1。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。 相似文献
20.
伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建 总被引：1，自引：1，他引：1
在伪狂犬病病毒转移载体pBdTK-Uni的多克隆位点中插入由SV40启动子控制下的IacZ基因表达盒,同时在右侧同源臂下游插入一个1.7kb的KpnI片段,构建成一个新的转移载体pUhi-LacZ.用该载体与Bartha-K61株基因组通过脂质体法共转染Vero细胞,经过10代蓝斑筛选纯化和PCR鉴定获得了一株稳定表达LacZ基因的伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株,命名为rPrV-LacZ.在不同的细胞(PK-15、IBRS-2、Vero和CEF)上,对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和细胞病变进行比较,未见显著差异.结果表明转移载体pBdTK-Uni具有实用性,可用于构建伪狂犬病病毒基因工程活载体疫苗. 相似文献