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1.
斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
根据本实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon)c DNA文库得到的EST序列,利用RACE技术获得了斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因(Pm GS)的c DNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量的方法研究了Pm GS基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 420bp,开放阅读框(ORF)为1 086 bp,3'非编码区(UTR)为294 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为40 bp。ORF可编码361个氨基酸,预测分子量为40.423 ku,理论等电点为6.19。序列含有一个谷氨酰胺结合结构域(Gln-synt_C),8个磷酸化位点,2个糖基化位点。斑节对虾和中国明对虾的GS基因的相似性最高,达99%。Pm GS-mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在淋巴组织中表达量最高,其次为鳃组织,在胸神经中的表达量最低。96 h高浓度氨氮胁迫后,Pm GS-mRNA在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组,但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P0.05)。以上结果暗示,Pm GS在氨氮代谢方面具有重要的作用,可能参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。 相似文献
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【目的】克隆斑节对虾(Penaeusmonodon)泛素结合酶E2 H基因(UBE2H),了解其组织特异性表达情况,为揭示UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的作用提供依据。【方法】PCR扩增斑节对虾UBE2H基因的开放阅读框,利用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因在斑节对虾各组织及不同发育期斑节对虾肝胰腺和卵巢中的表达情况;并构建pET32a-UBE2H原核表达重组质粒,进行诱导表达及蛋白纯化。【结果】克隆获得的斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp (GenBank登录号KU870456),其中,5'非编码区77 bp,3'非编码区378 bp,开放阅读框555 bp(编码184个氨基酸)。斑节对虾UBE2H蛋白等电点(pI)4.88,分子量20.85 kD。斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种相似度很高,为78.00%~83.00%。实时荧光定量PCR检测结果显示,UBE2H基因在斑节对虾淋巴组织中表达量最高,其次为鳃;在斑节对虾不同卵巢发育期肝胰腺和卵巢中的表达量均呈先上升后下降的变化趋势,但其峰值出现时间存在差异,肝胰腺的最高表达量出现在卵巢III期,卵巢的最高表达量出现在卵巢II期。经原核表达获得的斑节对虾UBE2H融合蛋白约39.00 kD,纯化后的蛋白浓度为2.92μg/μL。【结论】斑节对虾UBE2H参与了其卵母细胞发育和肝胰腺中卵黄蛋白的转运过程,与斑节对虾的卵巢发育密切相关。 相似文献
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采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。 相似文献
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用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性. 相似文献
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为研究口虾蛄Oratosquilla oratoria卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)基因,利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆口虾蛄Vg基因c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR422400),并应用相对实时荧光定量PCR技术检测雌雄口虾蛄不同组织、不同发育时期卵巢Vg mRNA的表达量。结果表明:口虾蛄Vg基因全长7727 bp,其中5'端非编码区为36 bp,开放阅读框(ORF)为7521 bp,3'端非编码区为170 bp,共编码2506个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为20个氨基酸的信号肽,1个类似于枯草蛋白酶的内切蛋白酶识别位点(RSKR),3个潜在的N-连接糖基化位点,1个在无脊椎和脊椎动物卵黄蛋白原中都比较保守的KALGNVG基序;对其结构域分析表明,口虾蛄Vg蛋白含有4种保守结构域,分别为卵黄蛋白原N端结构域(Vitellogenin_N)、血管性血友病因子(v WFD)和两种未知功能结构域(domain of unknown function)DUF1943与DUF1081;经NCBI BLASTP同源性比较,口虾蛄Vg氨基酸序列与其他甲壳类的相似性为46%~52%;系统发育分析结果显示,口虾蛄Vg单独聚为一支;实时定量PCR结果显示,口虾蛄Vg基因在性腺和肝胰腺中均有表达,在肌肉中均不表达,卵巢中Vg mRNA的表达量显著高于其他组织(P0.05),且口虾蛄Vg mRNA的相对表达量随着卵巢的发育不断增加(P0.05),在成熟期时达到最高值,随后显著下降,Vg mRNA表达量在卵巢中的变化规律可以作为了解口虾蛄性腺发育的有效指标。本研究结果为口虾蛄Vg蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
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利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。 相似文献
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利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。 相似文献
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采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa~175aa)和CARP(65aa~102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%~53%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。 相似文献
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为进一步了解ML家族基因在斑节对虾先天免疫中的作用，采用PCR和RACE方法克隆到斑节对虾(Penaeus monodon)2个ML家族基因PmML1和PmML2，并对其进行生物信息学分析，同时通过实时荧光定量PCR技术分析2个ML家族基因在斑节对虾各组织的表达分布。结果显示:PmML1的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为462 bp，编码153个氨基酸；PmML2的ORF为471 bp，编码156个氨基酸。2个基因都具有1个典型的ML家族蛋白结构域。多重比对结果显示，2个基因的ML结构域与组成3对二硫键的半胱氨酸残基位置都相对保守。氨基酸序列对比结果显示，PmML1和PmML2之间的相似性仅为42.37%。PmML1与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的ML蛋白MjML4的相似性最高，比例高达91.5%，PmML2与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的ML蛋白相似性最高，比例高达88.46%。系统进化分析结果显示，PmML1和PmML2存在于2个不同的分支，说明2个基因的进化相对独立，证明本研究中鉴定到的是2个不同的基因。实时荧光定量PCR结果显示，PmML1在对虾眼柄中的表达量最高，其次为肠、胃、心、鳃、肌肉和肝胰腺，在血细胞的表达水平最低；PmML2在眼柄中表达量最高，其次为肠、鳃、胃、血细胞、心、肝胰腺和肌肉，在肌肉中的表达水平最低。眼柄是重要的神经内分泌调节器官，推测PmML1和PmML2可能在斑节对虾神经内分泌调控等过程中发挥重要作用。 相似文献