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《林业科学》2021,57(4)
【目的】我国需要大量人工林来满足木材需求,而速生林的木材品质有待改良。研究木材形成的基因调控是材性改良的基础。为加速鉴定木材形成相关基因的研究,建立一种快速、便捷、高效的瞬时转化体系尤为重要。【方法】采用显微切片,观察1年生银腺杨84K休眠茎段水培下的形成层活动规律;以其作为瞬时转化受体,增强型绿色荧光蛋白(e YGFP)作为报告基因,构建表达载体,采用农杆菌介导真空渗透侵染方法进行84K茎段的瞬时转化。并通过L9(34)正交试验对农杆菌GV3101侵染浓度、真空渗透侵染时间、真空渗透侵染次数及侵染后培养时间进行优化。【结果】银腺杨84K 1年生枝条室温水培条件下可以解除休眠,形成层在水培15天左右活动已比较旺盛,并出现新分化的导管。培养约30天,木质部大量积累。这说明枝条经1个月时间可以完成形成层的分化、木质部的形成等木材形成的全过程。从形态上观察,形成层、木质部和韧皮部的生长发育过程与正常树木没有差异。采用农杆菌介导真空渗透侵染方法,茎段及切片在激发光下可在形成层区域观察到绿色荧光,说明茎段转化成功。进一步通过正交试验分析,表明4个转化条件对转化率的影响依次为:侵染后水培天数真空渗透侵染时间菌液浓度真空渗透侵染次数。农杆菌介导真空渗透瞬时转化银腺杨84K茎段的最优组合是农杆菌重悬液浓度OD600为0.9、真空渗透侵染20 min、真空渗透侵染2次、侵染后水培15天。【结论】建立了农杆菌介导的银腺杨84K茎段真空渗透侵染瞬时转化体系。这一体系可快速鉴定参与维管组织分化相关基因的功能,有助于揭示木质部发育的调控机制。同时该方法也可为研究其他木本植物的木材形成相关基因提供借鉴。 相似文献
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国槐离体再生及抗虫基因sck的转导 总被引：3，自引：0，他引：3
以国槐叶片作为外植体,筛选出诱导不定芽分化的最佳培养基;利用根癌农杆菌介导法将经过修饰的广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck(Signal-CpTI-KDEL)导入国槐.国槐叶片与农杆菌共培养结束后,转移至筛选培养基MS BA 3 mg·L-1 IAA 0.05mg·L-1 G418 8 mg·L-1 Cef 500mg·L-1上.不定芽在培养基1/2MS IBA 1.0 mg·L-1 G418 10 mg·L-1 Cef 100 mg·L-1上进一步培养获得完整再生植株.通过PCR和Southern blotting检测证明,修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck已成功导入国槐细胞. 相似文献
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以烟草无菌苗叶片为外植体,利用叶盘法,将含生长素应答基因(auxin response factor,ARF)的根癌农杆菌LBA4404携带双元质粒载体(pBin438)介导进行遗传转化.结果表明:诱导烟草叶片不定芽的最佳分化培养基为MS 0.8 mg.L-16-BA 0.05mg.L-1NAA,生根培养基为1/2MS 0.02 mg.L-1IBA 0.02 mg.L-1NAA,分化率、生根率分别为96.9%、96.7%;将预培养3 d的外植体与农杆菌菌液浸染3~5 min后,共培养2~3 d,然后转化到含Km75 mg.L-1的选择培养基上进行分化筛选,再转入Km为75 mg.L-1、100 mg.L-1的培养基上进行生根筛选,生根率为66.1%;与对照相比,转基因烟草在形态上发生了明显的改变,叶片颜色变深绿,叶片增厚,主叶脉变粗壮等.PCR扩增,获得40株阳性转基因苗,证明ARF基因已导入烟草中. 相似文献
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以含有RD29A目的基因和NPTⅡ筛选基因的根癌农杆菌菌株LBA4404、GV3101和EHA105侵染饲用型四倍体刺槐(Robinia pseudoacacia)、国槐(Sophora japonica L.)和红叶石楠(Davidson Photinia)的组培苗叶片,研究3个树种对根癌农杆菌菌株和不同抗生素(替门汀和头孢霉素)的敏感性、以及根癌农杆菌菌株对3个树种的侵染能力。结果表明,不同树种、不同根癌农杆菌株和不同抗生素种类均对转化效果产生明显影响,红叶石楠是最佳受体材料,3个菌株侵染后的平均抗性愈伤率为37.0%,其次为国槐,四倍体刺槐最低;根癌农杆菌菌株LBA4404侵染能力最强,3个树种的平均抗性愈伤率达到33.3%、平均分化率达到17.6%;替门汀对农杆菌侵染后的红叶石楠组培叶片抑菌效果最好。 相似文献
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耐盐基因Bet—A转化小黑杨的研究 总被引：28，自引：3，他引：28
本研究建立了小黑杨 (Populussimonii×P .nigra)组培再生体系 ,确定小黑杨芽分化最适宜培养基、生根培养基 ,然后进行卡那霉素敏感性试验。以小黑杨无菌苗叶片为转化受体材料 ,通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacien)介导法将外源基因Bet A(编码胆碱脱氢酶 ,催化胆碱生成甘氨酸甜菜碱 )导入小黑杨(P .simonii×P .nigra)。对获得的 11株转化苗进行了PCR扩增检测和斑点杂交检测 ,其中 7株获得了 1 7Kb特异性扩增条带和杂交斑点 ,表现为阳性。从斑点杂交检测的转化苗中选取 3株杂交斑点明亮的转化子进行Southern印迹杂交分析 ,结果证实外源基因已整合到小黑杨基因组中 相似文献
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《林业科学》2021,(8)
【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。 相似文献
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利用农杆菌介导法将与植物纤维素合成有关的纤维素合成酶基因导入喜树体内,并对影响遗传转化效率的几个因子进行了研究,建立了有效的喜树遗传转化体系。采用预培养的外植体在OD600(0.5)的农杆菌菌液中侵染10分钟,外植体与农杆菌侵染后在再生培养基上与农杆菌共培养三天,然后转入筛选培养基,获得了最佳的转化效率。Southern杂交结果证明UGPase基因已经整合到喜树的基因组中。在最佳的转化条件下获得了 6%的转化效率。这个转化系统对于利用遗传转化对喜树进行遗传改良是非常有意义的。 相似文献
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以豫杂一号泡桐健壮组培苗为研究材料,从低温锻炼时间、预处理时间、装载液处理时间、玻璃化液处理时间及液氮保存时间5个方面研究其茎尖玻璃化法超低温保存方法。结果表明,豫杂一号泡桐茎尖玻璃化法超低温适宜的保存方法为,2 cm的茎尖在附加0.4 mol·L-1甘油和0.3 mol·L-1蔗糖的MS培养基上预培养2天,然后剥取2～3 mm的茎尖,用装载液(MS+2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1蔗糖)装载60 min,再用玻璃化溶液(PVS2)于0℃下处理1.5 h,换1次玻璃化溶液后迅速投入液氮,保存l h后于40℃水浴中化冻70 s,再转到室温下用去装载液(MS+1.2 mol·L-1蔗糖)洗涤2次,每次10 min。以TTC法检测,豫杂一号泡桐茎尖成活率最高可达85.74%,保存效果较好。 相似文献
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杨树转化受体系统再生初步研究及卡那霉素敏感性测定 总被引：8，自引：0，他引：8
以欧关杨108为试材，对组培苗叶片、茎段进行初步的转化受体系统研究和对选择性抗生素卡那霉素的敏感性测定，为杨树的基因、转化及转化选择提供基础。通过实验认为，以叶片与茎段为转化受体材料，虽然茎段诱导率高于叶片，但叶片长势上要好于茎段，叶片诱导率能达到转化的要求；叶背不宜为受体材料，叶片伤口不宜过大；腋芽的存在与否，在诱导率上没差别，都可达100％，但腋芽有利茎段分化和分化芽的生长。从多个角度来分析用于筛选转化苗的卡那霉素下限浓度，以叶片为转化受体时，为30mg／L；以茎段为转化受体时，为50mg／L；生根阶段，下限为30mg／L。 相似文献
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采用含有激素合成相关基因的根癌农杆菌，伤口接种已感染植原体的泡桐丛植组培苗和健康组培苗，结果发现对丛植苗的致瘤能力明显低于健康对照苗，且被接种病苗的丛枝症状缓解，从健苗获得的T-DNA转化泡桐瘤组织细胞能在无激素培养基上稳定生长和连续继代培养2年以上，说明瘤组织细胞自身已获得了细胞分裂素和生长素合成能力，根据已报道的根癌农杆菌株系pTil5955T-DNA的异戊烯基转移酶基因（ipt)的保守序列，设计了一对引物（CYT和CYT′），用多聚酶链式反应（PCR）扩增了我国杨树致瘤农杆菌ipt基因部分序列（427bp片段），也从遗传转化的两个泡桐无性系瘤组织At-ZH和At-T35扩增出此特异片估，从而进一步肯定了T-DNA已被整合到泡桐的染色体上表明泡桐易于通过Ti质粒载体途径进行基因转移操作，但用此引物未能从泡桐、甘薯健株和感染植原体的组培病苗扩增出相应的427bp特异片段，当用此遗传转化瘤组织嫁接病苗时，可减轻从枝症状的严重度，延长病苗的存活时间和诱导病株生根，这进一步证实了泡桐在与植原体相互作用过程中激素代谢发生了变化。 相似文献
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根据GenBank中检索到的苹果谷氨酸受体基因（GLRs）的EST序列,采用RACE方法克隆平邑甜茶谷氨酸受体同源基因MhGLR。该基因全长3600 bp,编码946个氨基酸,推测分子质量为107.809 ku。将MhGLR编码氨基酸与其他已知的谷氨酸受体氨基酸进行同源性比较,发现MhGLR属于谷氨酸受体第三亚家族（GLR3）,且与拟南芥AtGLR3.6的同源关系最近,故将其命名为MhGLR3.6（GenBank注册号：EF432572）。亲水性分析表明,MhGLR3.6包含有动物离子型谷氨酸受体（iGLuRs）的6个具有重要功能的保守结构域。荧光定量PCR结果显示,MhGLR3.6在根、茎、叶中均有所表达,且在叶中的表达量最高;L-谷氨酸和IBA处理能够诱导根中MhGLR3.6的表达。成功构建了35S：：MhGLR3.6反义表达载体,并对‘皇家嘎拉’苹果进行农杆菌介导的遗传转化。 相似文献
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平邑甜茶谷氨酸受体同源基因的(MhGLR3.6)克隆、表达及转化 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中检索到的苹果谷氨酸受体基因(GLRs)的EST序列,采用RACE方法克隆平邑甜茶谷氨酸受体同源基因MhGLR.该基因全长3600 bp,编码946个氨基酸,推测分子质量为107.809 ku.将MhGLR编码氨基酸与其他已知的谷氨酸受体氨基酸进行同源性比较,发现MhGLR属于谷氨酸受体第三亚家族(GLR3),且与拟南芥AtGLR3.6的同源关系最近,故将其命名为MhGLR3.6(GenBank 注册号:EF432572).亲水性分析表明,MhGLR3.6包含有动物离子型谷氨酸受体(iGLuRs)的6个具有重要功能的保守结构域.荧光定量PCR结果显示,MhGLR3.6在根、茎、叶中均有所表达,且在叶中的表达量最高;L-谷氨酸和IBA处理能够诱导根中MhGLR3.6的表达.成功构建了35S::MhGLR3.6反义表达载体,并对‘皇家嘎拉'苹果进行农杆菌介导的遗传转化. 相似文献
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为了在地被菊中建立外源基因的转化体系和获得转基因地被菊美矮黄植株,利用农杆菌介导法在地被菊美矮黄中建立了转化体系,并获得了转入外源基因CHS的转基因植株,PCR-Southern杂交和Southern杂交都已经证实了外源基因的转入.研究中发现潮霉素对转化植株分化具有一定的抑制作用. 相似文献
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转果聚糖蔗糖转移酶基因银腺杨的获得 总被引：8，自引：0，他引：8
采用农杆菌介导的遗传转化方法,将来自枯草杆菌的果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB)导入银腺杨,以提高杨树对水分胁迫的抗性。以来自无菌培养的叶片为外植体,通过大约10 0 0个叶盘与农杆菌LBA4 4 0 4共培养,将植物双元表达载体pKP中SacB基因导入银腺杨基因组,经卡那霉素筛选后,共获得10 2株卡那霉素抗性植株。经PCR特异性扩增和Southern点杂交分析,证明其中97株再生植株基因组DNA中整合了SacB基因。对其中的6 2个无性系进行RT PCR分析,结果表明SacB基因在其中的5 0个无性系中获得表达。温室生长观察表明,转基因无性系外部形态与对照相比没有稳定的显著差异,少数部分转基因无性系的生长明显受到抑制,其他转基因无性系生长正常。这些转基因无性系的获得为培育抗旱转基因杨树奠定了基础。 相似文献
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泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质亚细胞定位及质谱鉴定 总被引：6，自引：1，他引：5
借助胶体金免疫电镜和质谱分析技术,利用制备的专化性抗体,进行豫杂一号泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质(m 24 ku,pI 6.8)叶片和茎尖的亚细胞定位和质谱鉴定研究.结果显示:豫杂一号泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质分布于健康苗叶片和茎尖细胞的细胞壁、液泡和叶绿体部位,患病幼苗叶片和茎尖细胞相同亚细胞器部位未发现该蛋白质的存在,进一步表明植原体侵染阻断了此蛋白的合成.此外,基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)分析该特异蛋白后,通过查询MSDB数据库初步断定该特异相关蛋白为水稻叶绿体分子伴侣Q6K822-ORYSA的同源蛋白. 相似文献