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1.
[目的]建立快速检测沙门氏菌的环介导等温扩增（LAMP）技术。[方法]以沙门氏菌的特异性基因（invA）序列为靶序列设计引物,并对该序列进行等温扩增;对Mg2＋浓度、反应温度和反应时间扩增条件进行优化,并对沙门氏菌进行检测和鉴定。[结果]在Mg2＋浓度为2.0mmol/L时,62℃反应40min,扩增可达最佳效果,LAMP法检测的灵敏度为7.8cfu/ml。[结论]建立了快速检测沙门氏菌的LAMP技术,该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,便于在基层推广,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。 相似文献
2.
[目的]研究新菠萝灰粉蚧的种特异性ITS引物,以快速准确鉴定该虫,可为口岸快速通关提供依据.[方法]采用PCR扩增方法,首次测定分析了11种粉蚧39个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列.基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物,通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法.[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带,能有效扩增出约665 bp的DNA片段,其余种类均未有扩增条带.灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高,其检测限可达0.1 ng/μL.[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定,该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考. 相似文献
3.
正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究 总被引：8，自引：1，他引：7
[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Toq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16（4^4）优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3．5×10^2 cfu／ml、沙门氏菌为2．2×10^2 cfu／ml、志贺氏菌为1．0×10^2 cfu／ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。 相似文献
4.
食源性致病菌污染是食品安全问题的重要隐患之一,沙门氏菌是食品中最常见的食源性致病菌。为快速检测食品中的沙门氏菌,满足食品生产过程中实时检测监控的需要,基于竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)技术,建立一种操作简便、准确性高、灵敏度高的沙门氏菌快速检测方法。以沙门氏菌invA基因保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计特异性引物,并在己筛选获得沙门氏菌的CAMP引物基础上,应用CAMP引物设计推荐规则及作用位点,进行加速引物的设计和筛选,评估加速引物对扩增反应的影响;并且对建立的方法进行特异性及灵敏性的检测评估。同时与PCR方法进行比较。结果表明:以沙门氏菌invA基因为目标核酸所设计的一对CAMP引物可以实现对沙门氏菌的快速检测,而且在反应体系中引入加速引物可以将检测时间缩短15min;PCR方法的检测限为103CFU·mL-1,而本研究所建立的方法在65℃恒温条件下80min内检出沙门氏菌,检测限为10CFU·mL-1,检测效率和灵敏度均优于传统PCR方法,而且操作简便,无需精密、复杂的变温仪器;对3株沙门氏菌和10株非沙门氏菌进行特异性检测,3株阳性对照株检测全部为阳性,10株阴性对照菌检测全部为阴性,说明本试验所建立沙门氏菌快速检测方法具有良好的特异性,而且对沙门氏菌无漏检,具有较好的通用性。 相似文献
5.
[目的]建立一种同步检测肉品中金黄色葡萄球菌与沙门氏菌的双重聚合酶链式反应.[方法]采用7.5;氯化钠肉汤和GN增菌剂分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行增菌,根据金黄色葡萄球菌的femA基因与沙门氏菌的invA基因设计引物,通过PCR反应对目标基因进行扩增,并对反应体系进行优化.[结果]特异性实验显示引物特异性良好,经双重体外扩增体系优化显示条带清晰,无非特异性的扩增条带.[结论]双重PCR是一种灵敏度高的快捷检测方法,可为这两种致病菌的同时检出提供新途径. 相似文献
6.
[目的]设计用于扩增地中海实蝇的特异性引物,建立快速、灵敏检测地中海实蝇的实时荧光PCR方法.[方法]采用实蝇科昆虫线粒体DNA COI基因的通用引物扩增地中海实蝇以及其它三种供试实蝇的DNA片段,经测序、比对分析,设计出扩增地中海实蝇的特异性引物,用SYBR Green实时荧光PCR方法验证该引物的特异性与灵敏度.[结果]设计的引物对DZH-F/DZH-R能特异性检测出地中海实蝇,扩增产物的溶解曲线峰值Tm为79.2.该对引物检测地中海实蝇的灵敏度为10-3 ng/μL.[结论]所建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法检测地中海实蝇特异性强、灵敏度高. 相似文献
7.
[目的]建立快速检测宠物食品中沙门氏菌(Salmonella)的荧光定量PCR方法。[方法]根据Genbank中登录的沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因序列设计合成引物和探针,检测该方法的特异性和敏感性。[结果]该方法具有良好的特异性,对沙门氏菌的检测灵敏度可达到17 CFU/反应(25μl/反应)。应用该方法检测人工污染宠物食品,样品经18 h增菌后,结果均为阳性。[结论]该研究建立的Taqman荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测宠物食品中的沙门氏菌。 相似文献
8.
转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测 总被引：6，自引：2，他引：4
[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计特异性引物进行PCR检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1142bp的3′端旁侧序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性从MON89788大豆中扩增出170bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。 相似文献
9.
根据GenBank上公布的沙门氏菌invA基因序列中的保守区域,设计一套环介导等温扩增(LAMP)引物,将其用于沙门氏菌的检测,结果成功地扩增出特异性的梯形条带。LAMP方法检测沙门氏菌纯培养的灵敏度为1.04×102 cfu.mL-1,对11株不同细菌进行LAMP检测,仅沙门氏菌获得阳性结果。应用该方法对扬州市场上销售的鸡蛋进行沙门氏菌检测,检测结果与传统培养方法相符合。因此,LAMP方法检测沙门氏菌具有灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便等特点,有望发展成为快速检测鸡蛋中沙门氏菌的有效手段。 相似文献
10.
转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文） 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计3条特异性引物用于旁侧序列的扩增。经过3轮PCR扩增,获得特异性扩增产物,将此产物回收后克隆到pMD-18T载体上测序,所得序列用Vector NTI分析,并提交NCBI进行序列比对。并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1 142 bp的3′端旁侧序列。经Blast检索比对,该序列包括2部分,1 ～618 bp为载体序列（E9终止子部分序列和LB序列）,619 ～1 142 bp为大豆基因组序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性地从MON89788大豆中扩增出170 bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。 相似文献
11.
[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。 相似文献
12.
[目的]提高动物源性成分检测效率,建立PCR-核酸试纸条快速检测技术体系。[方法]针对物种特异性DNA序列,设计并标记引物;建立并优化PCR反应体系;利用通用核酸试纸条进行结果判读。[结果]试验表明,PCR-核酸试纸条特异性高;绝对灵敏度为0.001 3 ng/μL,混合样品,实际灵敏度为0.01%;加工处理样品,实际灵敏度为0.1%;最低检测限检出率为100%,稳定性良好。[结论]综上,PCR-核酸试纸条方法是一种既有PCR反应的高灵敏度,又具有免疫学检测的特异性好的特点,同时操作简便的快速检测方法。 相似文献
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鹅源性成分PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]建立一种检测鹅源性成分的PCR方法。[方法]以15种动物的DNA为模板,利用鹅的特异性引物进行PCR反应,PCR产物用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序,检测引物的特异性和敏感性。[结果]通过PCR反应从鹅样品中扩增到了304bp的目的片段,其他物种火鸡、鸭、鸽鹑、鸵鸟、鸽子、鸡、马、牛、羊、猪、狗、驴、猫、鱼和空白对照则无目的片段,表明该引物的特异性良好。鹅组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列基本符合,相似性为98％;PCR检测方法的检测灵敏度为0．01％。[结论]该PCR检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高、可重复性好,为明确食品与饲料的成分和来源,预防禽流感的传播提供了有效的分子生物学捡测方法. 相似文献
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为建立快速检测临床1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法,根据DHAV-1的vp1基因序列设计1对引物,以DHAV-1及其他常见的感染鸭的病毒基因组为模板,建立了DHAV-1的特异性RT-PCR检测方法;以10倍梯度稀释的DHAV-1 RNA为模板,测定该方法的灵敏度;采集江苏多地的疑似DHAV-1感染病料,提取基因组进行RT-PCR扩增,产物经测序鉴定后判断所建立方法的检测率。结果显示,建立的方法可以特异性扩增DHAV-1 vp1基因保守区360 bp的序列,最低可检测1 fg基因组模板,对临床样品检测率为100%。表明,成功建立了特异性强、灵敏度高且可以用于临床快速诊断DHAV-1感染的方法。 相似文献
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[目的]建立快速准确地检测食物样品中食源性致病菌的体系。[方法]配套湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发的微生物分子检测仪,建立一种基于Taq Man探针法的阪崎肠杆菌q PCR检测体系。[结果]体系建立成功,标准曲线斜率为-3.44,R~2=0.995 5,扩增效率为95.3%。[结论]该q PCR体系特异性强,灵敏度高,明显缩短了检测时间,并具有良好的稳定性与重复性,为食品中阪崎肠杆菌的高通量和自动化检测提供了一个新的途径。 相似文献
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肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
用传统的分离鉴定方法从临床采集的12例不同蛋鸡样本中分离到1株肠炎沙门氏菌。为避免传统鉴定技术中可能出现的假阳性等问题,依据SEF 14菌毛是肠炎沙门氏菌的特异性粘附素这一特性,设计编码该粘附素基因中相对保守片段的1对引物,对上述可疑菌株进行PCR扩增,以含有编码SEF 14菌毛操纵子全基因的质粒DNA、标准株SD-2染色体DNA作为阳性对照,鸡白痢国内分离株SP染色体DNA作为阴性对照。PCR扩增结果显示分离株出现1条与预期大小498 bp一致的特异性扩增条带,阳性对照也出现相同大小的条带,而阴性对照则未出现。结合传统的细菌学分离鉴定和特定的分子生物学鉴定,将此可疑分离株确定为肠炎沙门氏菌。该方法可快速、准确、敏感地检测肠炎沙门氏菌。 相似文献
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副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。 相似文献