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1.
设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1 CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1 CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。 相似文献
2.
[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。 相似文献
3.
目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础. 相似文献
4.
《南京农业大学学报》2014,(5)
构建含有Zic3基因的真核表达载体pEGFP-Zic3,并转染小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC),观察BMSC中Zic3的表达情况。用RT-PCR技术获得Zic3基因,并将其连接到真核表达载体pEGFP-C1中,获得真核表达载体质粒pEGFP-Zic3,采用双酶切法和DNA测序鉴定构建的载体是否正确。体外培养小梅山猪BMSC,通过免疫细胞化学法检测小梅山猪BMSC表面标志。采用脂质体法将pEGFP-Zic3转染BMSC,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在小梅山猪BMSC内的表达和定位,用RT-PCR法检测Zic3的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。双酶切和测序证实已成功构建含目的基因Zic3的真核表达载体pEGFP-Zic3;小梅山猪BMSC体外培养状态良好,且表达CD29,不表达CD34和CD45;pEGFP-Zic3转染BMSC后可见大量绿色荧光,与对照组相比,转Zic3基因BMSC增殖能力提高,但细胞凋亡率未发生明显变化。结论:成功构建了含目的基因Zic3的真核表达载体pEGFP-Zic3,并高效转染BMSC,Zic3表达增加,且Zic3可提高细胞增殖能力。 相似文献
5.
FADD(Fas-associated death domain protein)存在于Fas/FasL系统中,是信号传导通路的一个信号连接蛋白,FADD通过传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。为进一步验证FADD基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将FADD基因连接到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建过表达FADD基因载体,并构建FADD基因的RNAi载体;用脂质体介导法将FADD基因RNAi载体、真核表达载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,观察有无荧光的表达,并使用Real-Time qPCR和Western blot方法检测FADD基因mRNA、蛋白水平的表达情况。结果表明:成功构建出FADD基因RNAi载体和高表达载体,重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率可达50%。 相似文献
6.
根据Gen Bank上发表的PPV的基因组序列,设计扩增非结构蛋白NS1基因的特异性引物。通过PCR方法克隆NS1基因,经双酶切及与pEGFP-N1载体连接构建了真核表达载体pEGFP-N1-NS1,将双酶切和测序鉴定正确的质粒转染至293T细胞,经过荧光观察和PCR方法鉴定。结果表明,克隆了猪细小病毒NS1基因的全序列1989 bp,成功构建了NS1基因的真核表达载体,并在293T细胞中转染表达。 相似文献
7.
构建pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体,并观察其在3T3-L1前脂肪细胞中的转染状况。采用分子克隆技术,将PLIN2基因连接到p MD18-T载体中做Eco RⅠ/Sal I双酶切,将酶切产物回收并将双酶切后的目的片段与pIRES2-AcGFP1载体连接,转入DH5α感受态细胞,并提取pIRES2-AcGFP1-PLIN2阳性重组质粒,转染到3T3-L1前脂肪细胞,显微镜观察转染情况。本研究成功克隆出了PLIN2基因,同时成功构建了pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表达载体,并在3T3-L1前脂肪细胞中成功表达,于显微镜下观察到绿色荧光,试验为进一步研究PLIN2基因对脂肪细胞的调控机理奠定了基础。 相似文献
8.
为构建猪源抗菌肽PR39的高效表达真核载体pVAX1-PR39,通过猪股骨骨髓组织基因组RNA合成c DNA,根据PR39基因全长序列,设计高效表达启动子,利用PCR扩增获得PR39全长基因,连接到真核载体pVAX1,构建重组载体pVAX1-PR39。转化大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR鉴定和测序,测序结果与NCBI网站上猪源抗菌肽PR39基因序列完全一致,表明已成功构建了猪PR39的真核表达载体,理论上所构建的PR39表达载体能够提高猪的免疫能力。 相似文献
9.
[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。 相似文献
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小麦矮秆基因Rht3和赤霉酸不敏感基因Gai3与a—淀粉酶的表达 总被引：6，自引：0，他引：6
以小麦赤霉酸反应不敏感的Ｒｈｔ３矮秆基因两个近等基因系及其分离群体为材料,分析了Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３与ａ－淀粉酶表达的相互关系。结果表明,Ｒｈｔ３、Ｇａｉ３能强烈地抑制萌发籽粒ａ－淀粉酶的表达,降低ａ－淀粉酶活性水平。高矮亲本间ａ－淀粉酶活性差异明显,矮扬３、矮苏３和扬麦３号、苏麦３号的ａ－淀粉酶ＯＤ值分别为０．０７１,０．０８０和０．０６３５,０．７２０。经Ｘ＾２测验,两群体中ａ－淀粉酶生高、中、 相似文献
12.
从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。 相似文献
13.
人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性的特点,被认为是肿瘤凋亡疗法较有希望的候选药物。植物生物反应器在药用蛋白质生产方面具备较大优势。构建了可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的植物表达载体,进行本氏烟(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,并对目的蛋白的体外活性进行检测。结果显示,本氏烟叶片中目的蛋白平均表达量为68.60 pg/mg TSP;在浓度为200 pg/m L时,对NCI-H460细胞株的抑制率为28.75%。研究表明,经密码子优化的编码基因能够在受体植物中表达出有活性的目的蛋白,为开展目的基因的稳定转化工作奠定了基础。 相似文献
14.
[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。 相似文献
15.
《山西农业科学》2017,(5)
为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10~(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。 相似文献
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【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。 相似文献
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《黑龙江八一农垦大学学报》2015,(4)
为了构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并检测其在籽鹅颗粒细胞中的瞬时表达。利用PCR技术合成籽鹅FSH全基因后,构建促卵泡素α、β亚基真核表达载体,并转染籽鹅卵泡颗粒细胞。结果表明:基因片段已正确插入真核表达载体,同时在颗粒细胞中检测到pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β的融合蛋白表达。说明已构建真核表达载体pEGFP-FSH-C2-α和pEGFP-FSH-C2-β,并在颗粒细胞瞬时表达成功,为研究和开发生物制剂奠定基础。 相似文献
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动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状，而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动，获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料，通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体，使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry；使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达，而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白，对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。 相似文献
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小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。 相似文献
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The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector of mouse Nanog gene and to express it in E. coli. A pair of primers was designed according to digestion sites in plasmid pGEX-KG and the Nanog gene sequence published by GenBank. The DNA fragment of 918 bp was amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the pNA992 recombinant plasmid with Nanog gene, then cloned into pGEX-KG and transformed into the host E. coli strain TG Ⅰ. The sequence of the fragment was matched with the original sequence of pNA992. It indicated that fusion expression vector, pGEX-KG- Nanog, was constructed successfully. The pGEX-KG-Nanog plasmid was extracted from E. coli strain TG Ⅰ and was transformed into BL21（DE3） for expression. After induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG） at 37℃, the expression product of Nanog gene was identified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）, and the expression condition was optimized. Nanog fusion protein was successfully expressed in the form of inclusion bodies. The molecular weight of the inclusion body was 63 kDa. Meanwhile, the optimum condition for the expression of Nanog fusion protein was induced with 0.8 mmol L^-1 IPTG for 5 h. The mouse Nanog gene was successfully expressed in E. coli, which laid a foundation for the purification of Nanog protein and for the preparation of polyclonal antibody. 相似文献