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1.
构建了环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)的DNA疫苗载体pVAX1-COX-2, 并考察在COS-7细胞中表达. 用RT-PCR法从肺癌A549细胞中获得环氧合酶-2基因片段, 此片段插入pVAX1载体构建pVAX1-COX-2真核重组表达质粒, 脂质体介导法转染COS-7细胞, 以pVAX1为对照, 收集稳定转染细胞, 利用RT-PCR和Western-blot分别在mRNA和蛋白水平上考察COX-2表达. 实验结果表明: RT-PCR法从A549细胞mRNA中扩增1.8 kb的COX-2基因片段, 酶切与测序结果表明所构建的真核表达载体pVAX1-COX-2与预期相符, 质脂体法成功地将质粒DNA转染到COS-7细胞中. RT-PCR和Western-blot分析结果表明COX-2已表达. 因此, 所构建的真核表达载体pVAX1-COX-2正确, 且在COS-7细胞中表达. 相似文献
2.
以白介素-1β(IL-1β)诱导的人肺癌细胞A549为模型,探讨原花青素(PC)对环氧合酶-2(COX-2)启动子活性的影响.用含有完整和NF-κB结合位点突变的COX-2启动子的的荧光素酶表达载体 pGL 3质粒,转染A549细胞,加原花青素(20mg/L)培养,检测COX-2基因5'调控区相对转录活性;RT-PCR检测细胞COX-2 mRNA的表达.结果发现NF-κB结合位点突变的COX-2基因转录活性极大地降低,原花青素可以显著降低完整的COX-2启动子转录活性,降低A549细胞中COX-2 mRNA的表达. 相似文献
3.
《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2016,(2)
以卡介苗(BCG)基因组、pEGFP质粒为模板,PCR扩增分别获得TB10.4基因片段、GFP-TB10.4融合基因片段,连接pVAX1真核表达载体,测序和酶切鉴定正确,分别命名为pVAX1-TB10.4和pVAX1-GFP-TB10.4;将重组质粒分别转染COS-7和HEK293T细胞,反转录PCR表明TB10.4基因成功转录,间接免疫荧光试验显示2种蛋白均能瞬时表达;再将重组质粒pVAX1-TB10.4免疫小鼠。结果表明:该质粒能够诱导低水平的抗体应答,同时诱发IFN-γ表达,并且能够加强BCG初次免疫后的免疫应答效果。该研究构建的真核表达质粒pVAX1-TB10.4能够诱导小鼠产生抗TB10.4免疫应答,为后续TB10.4蛋白生物学功能研究提供良好的生物材料。 相似文献
4.
鸡传染性支气管炎病毒S1基因的真核表达及其产物的免疫原性 总被引：4，自引：0，他引：4
采用RT-PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M 41株的全长S1基因,并将其片段连接到pGEM-T载体,经酶切、PCR及序列测定表明,获得的S1基因ORF全长为1 659 bp,与G enB ank上公布的IBV M 41 S1基因序列一致。将S1基因与真核表达质粒pVAX 1连接,构建重组真核表达质粒pVAX 1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测转染细胞S1蛋白的表达。同时以重组质粒免疫小鼠,可诱导产生特异性针对IBV S1蛋白的抗体(P<0.01)。这为鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
5.
利用PCR技术将鸡痘病毒env基因亚克隆到pVAX1真核载体上,构建了含有该基因的真核表达质 粒pVAX-env。将质粒pVAX--env体外瞬时转染BHK21细胞通过间接免疫荧光检测蛋白表达。将pVAX-env质粒肌肉注射免疫14日龄雏鸡,通过RT-PCR和组织免疫荧光检测体内质粒表达。结果表明,成功构建了真核表达质... 相似文献
6.
为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。 相似文献
7.
[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。 相似文献
8.
目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。 相似文献
9.
应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。 相似文献
10.
为研究猪IL-2真核表达质粒对乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗(Lactobacillus acidophilusSFMD-1)猪体免疫的分子佐剂效应,通过RT-PCR方法从猪的肠系膜淋巴结克隆猪IL-2基因,基于pRc/CMV2载体,构建编码猪IL-2的真核表达质粒pCSIL2,以RT-PCR方法分析了该质粒转染PK15细胞以后的mRNA表达。结果显示预期的429 bp IL-2带仅出现在pCSIL2转染细胞。试验猪单独免疫L.acidophilusSFMD-1或者联合免疫pCSIL2质粒,后者能够增强FMDV-VP1特异的T细胞和B细胞反应,免疫后5周,单独免疫组和联合免疫组的抗体水平分别为1.50和1.66;免疫后6周,抗体水平分别上升到1.83和2.28;在T细胞增殖试验中,L.acidophilusSFMD-1单独免疫组和pCSIL2联合免疫组的刺激指数(SI)分别为2.00和2.70。结果表明,联合应用IL-2真核表达质粒是改进乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗免疫原性和效能的有效方法。 相似文献
11.
利用RT-PCR方法从低氧预处理的A549细胞中获得HIF-1α基因片段,将其定向插入pIRES-SEQ质粒NheⅠ、MLuⅠ2个酶切位点之间,得到真核表达载体pIRES-HIF-1α;采用电转化方法将其电转化入减毒沙门氏菌Ty21α中,获得重组减毒沙门氏菌菌株TPH;转染A549细胞,RT-PCR法检测HIF-1α基因表达,ELISA方法检测HIF-1α蛋白表达;TPH菌株在氨苄青霉素(+)和氨苄青霉素(-)LB培养板上分别传代40代,每10代提取质粒进行PCR及酶切鉴定.结果表明:试验成功构建了携带HIF-1α基因的重组减毒沙门氏菌TPH,其可在体外细胞中稳定表达HIF-1α基因及蛋白,TPH可稳定遗传. 相似文献
12.
根据GenBank中登录的SARS-COV（BJ01株）基因序列设计引物，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从SARS病毒中扩增得到约3768bp的片段，将其克隆到真核表达质粒pVAX1，鉴定正确后．命名为pVAX1／S。体外转染Hela细胞．间接免疫荧光鉴定S蛋白的表达。构建的重组质粒经酶切及测序鉴定．开放阅读框正确；间接免疫荧光方法鉴定该重组质粒能在Hela细胞中表达。 相似文献
13.
通过RT-PCR从肺癌细胞株A549克隆环氧化酶2（cyclooxygenase2,COX-2）基因全长1．8kb,测序结果与已发表的一致;将该片段插入pET32-a（＋）载体中,构建原核表达载体pET-32-COX-2,转入BL-21中,IPTG诱导重组融合蛋白his—COX-2表达,SDS-PAGE分析71kD处有特异条带,与理论相符;Western blotting验证为COX-2蛋白;用镍离子螯合柱（Ni—NTA）纯化融合蛋白,获得纯度较高的原核表达蛋白．为其新型抑制剂的研发与抗肿瘤作用蛋白疫苗的研制奠定基础． 相似文献
14.
以PPV VP2为基础,利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并将突变体克隆入pMD19-T Simple载体中;经酶切、PCR和测序鉴定后,利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点,定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建突变体与报告基因EGFP融合表达的pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)真核表达载体;利用脂质体法将重组质粒分别转染COS-7细胞。结果:成功构建了突变体的真核表达载体;在转染后的荧光观察中发现,pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)质粒转染细胞后,两者表达后的荧光信号不同,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品的荧光信号均匀分布于细胞中。提示,突变是引起表达差异的主要原因。 相似文献
15.
《南京农业大学学报》2014,(3)
为了探讨脑心肌炎病毒(EMCV)非结构蛋白3C对IFN-β信号通路的影响,采用RT-PCR方法构建EMCV 3C蛋白的重组真核表达质粒pVAX1-3C,将其转染至HeLa细胞,采用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot验证其在真核细胞内的表达和分布定位情况;利用Real-time PCR方法检测HeLa细胞表达EMCV 3C蛋白后Ⅰ型干扰素(IFN)效应因子的相对表达量,并用含有双荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体检测分析3C蛋白在Ⅰ型IFN信号通路中的作用。结果表明:成功构建pVAX1-3C真核表达质粒,该重组质粒能在HeLa细胞内表达,并分布在细胞核中;pVAX1-3C重组质粒转染组细胞中Ⅰ型IFN效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS、PKR的相对表达量明显低于阴性对照;在双荧光素酶试验中,用poly(I:C)刺激各处理组后进行检测,转染了pVAX1-3C的细胞中IFN-β、IRF3及PRDⅡ启动子驱动的荧光素酶的表达量明显低于阴性对照;ISRE启动子驱动的荧光素酶结果显示,用IFN-β刺激后,与阴性对照组相比,转染pVAX1-3C的细胞中ISRE启动子的活性受到抑制。结论:EMCV 3C蛋白能够下调细胞Ⅰ型IFN效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS、PKR的mRNA水平,并能下调IFN-β、IRF3、PRDⅡ及ISRE启动子的活性,首次证明EMCV 3C蛋白能够抑制IFN-β信号通路。 相似文献
16.
应用RT-PCR技术从植物血凝素（PHA）活化的牛外周血淋巴细胞中扩增出牛白细胞介素4（IL-4）特异性目的片段,将其克隆到真核表达载体pVAX1,双酶切及测序鉴定正确后,将构建好的重组质粒pVAX1-IL-4应用脂质体Lipofectamine”2000转染至293T细胞,经RT-PCR检测IL-4可进行转录表达,且MTT检测其具有生物学活性,表明IL-4在转染细胞中可以成功表达。然后将构建好的pVAX1-IL-4作为基因佐剂来研究其对牛病毒性腹泻粘膜病毒（BVD）核酸疫苗pVAV1-E0的免疫增强作用。经ELISA和MTT检测结果表明,pVAX1-IL-4同pVAV1-E0联合免疫组小鼠的特异性抗体水平、淋巴细胞增殖水平与pVAV1-E0单疫苗免疫组相比差异显著（P〈0．05）。证明重组质粒pVAX1-IL-4可作为佐剂与核酸疫苗共同作用来提高后者的免疫原性。 相似文献
17.
目的构建PinX1真核表达载体,观察PinX1基因对乳腺癌MCF-7细胞生长和增殖的影响。方法重组质粒转染MCF-7细胞并筛选稳定表达系;用Real-timePCR检测PinX1基因mRNA的表达;MTT法检测转染前后细胞生长变化;平板克隆形成试验检测PinX1对MCF-7集落形成能力的影响。结果构建了真核表达载体PDsRed1-C1-PinX1的稳定表达系;转染后乳腺癌MCF-7细胞生长明显减缓,集落形成能力降低。结论 PinX1基因可抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长和增殖。 相似文献
18.
目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)S基因(包括Pre-S1,Pre-S2和S)的真核表达质粒.方法:将PCR克隆获得的Large surface antigen of HBV,Middle surface antigen of HBV和Small surface antigen of HBV基因片段通过T-A克隆插入真核表达载体Pcmv-Tag2B,构建重组质粒Tag2B-LS,Tag2B-MS和Tag2B-SS,经测序后转染293FT细胞,收取蛋白并鉴定.结果:分别双酶切构建的重组质粒,获得相应大小的DNA片段,且测序证实为有完整读码框的S基因,重组质粒分别转染293FT细胞并表达,经Western Blot鉴定证实.结论:成功构建真核表达质粒Tag2B-LS,Tag2B-MS和Tag2B-SS,并能正确表达,为进一步研究乙型肝炎病毒外膜蛋白的功能打下基础. 相似文献
19.
从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。 相似文献
20.
采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。 相似文献