共查询到15条相似文献，搜索用时 328 毫秒
1.
为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl2介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。 相似文献
2.
3.
4.
以优化原生质体的制备方法,建立小麦光腥黑粉菌的遗传转化体系为目的,研究了小麦光腥黑粉菌菌株培养时间、细胞壁裂解酶、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响。结果表明,以水琼脂培养基上培养7d的菌丝为初始材料,配置1.5%崩溃酶+1.5%溶壁酶+1.5%蜗牛酶的复合酶液,28℃酶解2 h后原生质体的获得率最高;以1.2 mol/L的氯化钾为渗透压稳定剂,得到的原生质体数量最多,且释放的原生质体能够均匀散乱分布,不聚集成堆;较适宜原生质体再生的培养基为TB3培养基,可产生较多的单菌落。 相似文献
5.
6.
由链格孢(Alternaria alternata)引起的梨黑斑病是我国梨生产上的主要病害之一,导致梨叶与果实产生黑斑症状及早期落叶,对我国梨产业的健康发展构成严重威胁。本实验在前期获得强致病性梨黑斑病菌菌株HN-5基础上,建立该病菌的遗传转化体系。通过优化原生质体制备过程以及转化体系发现梨黑斑病菌HN-5原生质体制备的最优条件为:菌丝在M R液体培养基中培养36 h;以0.7 M NaCl+0.8 M Mannitol为稳渗剂,配置复合细胞壁裂解酶(1%崩溃酶+1%裂解酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶),酶解菌丝3 h,原生质体的产量可达0.5×10~7个·mL~(-1)。通过PEG介导的原生质体遗传转化体系,将含有RFP基因的质粒p KD7转入链格孢菌HN-5中,转化效率为6个·μg~(-1)DNA。PCR检测和转化子荧光观察均表明RFP基因整合到了HN-5基因组中并成功表达。致病性分析发现RFP (Red Fluorescent Protein)标记转化子致病性未发生变化。本研究成功建立了PEG (Polyethylene glycol)介导的梨黑斑病菌遗传转化体系,构建了RFP标记菌株,为研究该病菌的致病机理奠定基础。 相似文献
7.
原生质体的制备是真菌遗传转化的基础,为了解芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi的遗传转化体系,以芦笋茎枯病菌Pa1100为供试菌株,研究了细胞壁裂解酶、酶解时间、稳渗剂等对芦笋茎枯病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明可制备芦笋茎枯病菌原生质体较为适宜的条件是：CM液体培养基中培养分生孢子3 d,以1.5%裂解酶、1%崩溃酶和1.5%蜗牛酶为组合酶解液,33 ℃水浴酶解4.5 h,以PBS（pH 6.98）与1 mol/L MgSO4混合液为酶解稳渗剂。含0.6 mol/L蔗糖的PDA培养基较适合于芦笋茎枯病菌原生质体的再生。 相似文献
8.
为了探索不同酶系组成对玉米弯孢叶斑病菌原生质体制备的影响,建立该病菌原生质体遗传转化系统,采用酶系混合物裂解菌丝体制备原生质体,采用PEG介导方法进行原生质遗传转化,通过PCR和Southern blotting技术对转化子进行验证。结果表明:1%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶混合酶系为玉米弯孢叶斑病菌原生质体制备的最佳酶系,可以产生原生质体6.78×106 cfu/mL。用PEG介导方法转化共获得16个稳定的转化子,从中随机挑取5个转化子发现质粒pV2已被成功整合到基因组中。本研究获得了制备玉米弯孢叶斑病菌原生质体的最佳酶系,建立了PEG介导的原生质体遗传转化体系,为开展该菌致病相关基因克隆和基因功能研究提供了一种手段。 相似文献
9.
禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)是引起我国小麦纹枯病的主要致病菌。为了建立高效稳定的禾谷丝核菌遗传转化体系,本试验比较研究了不同细胞壁降解酶、酶液浓度、酶处理温度和时间等因素对禾谷丝核菌原生质体制备的影响,利用正交设计试验优化了原生质体再生条件。结果表明,液体培养6d的菌丝,采用15mg/mL溶壁酶+10mg/mL蜗牛酶组成的混合酶液,30℃下酶解4h,可以获得较高的原生质体释放量,可达到3.0×106个/mL;禾谷丝核菌原生质体再生的最佳条件是以SuTC缓冲液作为渗透压稳定剂悬浮原生质体,采用单层混菌法接种于TB3再生培养基,原生质体再生率可达到58.6%。禾谷丝核菌原生质体制备和原生质体再生条件的优化,为深入研究禾谷丝核菌生长发育的分子遗传学基础和进一步探索小麦纹枯病的致病机理奠定了基础。 相似文献
10.
研究了多种细胞壁降解酶的种类和浓度、酶解时间、菌龄,以及渗透压稳定剂等因素对粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成和再生的影响。结果表明,粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成的适宜条件为:使用溶壁酶(3mg/ml)、蜗牛酶(3mg/ml)、纤维素酶(2mg/ml)的组合酶液酶解时间为2h,菌龄为14h,稳渗剂为NaCl(0·5mol/ml)。在上述条件下,原生质体产量达到9·25×106/ml。将原生质体涂布于含KCl(0·5mol/ml)的再生培养基上,再生率最高。显微观察表明,粉红粘帚霉67-1菌株主要通过顶端和侧位释放原生质体。 相似文献
11.
由辣椒胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides导致的辣椒炭疽病是辣椒生产上最为严重的真菌病害之一。本文以辣椒胶孢炭疽菌CSLL11为供试菌株,采用PEG-CaCl_2介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B抗性基因和eGFP表达基因的DNA片段成功转入辣椒胶孢炭疽菌的原生质体中,获得了稳定表达绿色荧光的转化子,从而成功建立了辣椒胶孢炭疽菌的遗传转化体系。试验结果表明,可有效筛选阳性转化子的潮霉素B浓度为500 mg/L;PCR及Southern blot结果显示,eGFP表达基因已单拷贝整合至辣椒胶孢炭疽菌转化子的基因组中;使用荧光显微镜观察第一代及继代培养后的转化子,菌丝与分生孢子均表现出强烈的绿色荧光信号,说明GFP能在转化子中稳定遗传;将转化子与野生型菌株相比,菌落形态、生长速率及致病力水平无明显差异。本研究建立了辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系并获得了稳定表达绿色荧光蛋白的转化子,对辣椒炭疽菌与寄主互作的研究及病害防治具有重要意义。 相似文献
12.
原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。 相似文献
13.
基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段,为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能,构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系。本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术,融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段,配置0.05 g·mL-1溶壁酶+0.01 g·mL-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转化,PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定,荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证,生物学表型(菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力)验证了PK基因敲除体系的成功构建。28℃酶解3 h获得了2×107个·mL-1原生质体;对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证,获得了纯合敲除突变体;荧光定量PCR检测转录水平无表达;Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交,基因缺失突变体无条带,野生型杂交到目的条带;生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型... 相似文献
14.