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1.
转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法. 相似文献
2.
绒山羊的绒毛品质、产量与皮肤毛囊的生长发育密切相关。本研究旨在构建绒山羊(Capra hircus)成纤维细胞生长因子5基因(fibroblast growth factor 5,FGF5)的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。分别以绒山羊基因组和c DNA为模板,利用PCR方法克隆角蛋白关联蛋白6-1(keratin associated protein 6-1,KAP6-1)基因的启动子和FGF5基因的编码区序列(coding sequence,CDS),并将这两个元件连接到去除CMV启动子的真核表达载体p EGFP-N1上,FGF5与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达框之间以猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)2A(P2A)相连,构建毛囊特异性表达载体p EGFP-N1-KF。表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞后,对细胞表达产物进行q RT-PCR和Western blot检测。酶切鉴定结果表明,载体p EGFP-N1-KF构建成功;q RT-PCR结果表明,FGF5正常表达;Western blot结果显示,P2A能够有效剪切FGF5和EGFP融合蛋白。表明成功得到了绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体并在绒山羊胎儿成纤维细胞中能正常表达。本实验为进一步研究绒山羊FGF5基因在毛囊发育和周期调控中的作用提供了技术支持。 相似文献
3.
采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段（GenBank登录号：EF026001）。序列分析显示该片段包括长为1643bpβ-actin基因5＇端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bpβ-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第1个外显子和第1个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT box,TATA box和CArG box,分别位于转录起始位点上游的-92、-29和-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼（Tanichthys albonubes）的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明,在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。 相似文献
4.
采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）基因组中分离了β-肌动蛋白（β-actin）基因片段。序列分析显示该片段包括长为1643bp的β-肌动蛋白（β-actin）基因5,端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bp的β-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件：CAAT Box,TATA Box和CArG Box,分别位于转录起始位点上游的-92,-29,-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoRⅠ线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因（DsRed2）在唐鱼中的表达。结果表明在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。该实验为下一步进行转自源基因尼罗罗非鱼的研究奠定了基础。 相似文献
5.
利用转基因技术转化利用外源抗性基因,可提高玉米对非生物逆境的抵抗能力,改良其在不良环境下的稳产性。但是,在过去的研究中,大多采用组成型启动子启动外源抗逆基因过量表达,虽然可以改良转基因株系的抗逆性,但其生长发育受到不同程度抑制,适应性代价较大。用非生物逆境诱导启动子,可培育出只在逆境胁迫下表达的转基因抗逆品种,避免正常条件下抗逆基因过量表达的不良影响。本研究以水稻HVA22蛋白质的氨基酸序列为探针,搜索玉米基因组同源mRNA序列HVA22,用PlantCARE软件分析并同源克隆其上游启动子序列,实时荧光定量PCR验证HVA22基因在非生物逆境胁迫下的差异表达,构建HVA22基因启动子HVA22s启动GUS基因的表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织,GUS染色检测启动活性。结果表明,玉米HVA22s启动子长度1478 bp,含有多种与非生物逆境应答相关的调控元件。HVA22基因在高温胁迫,以及脱落酸和乙烯诱导下上调表达。用HVA22s启动GUS基因转化的玉米愈伤组织,在脱落酸诱导、甘露醇模拟高渗处理、低温和高盐胁迫条件下,GUS染色均可显现靛蓝色斑点,说明HVA22s启动子确有非生物逆境启动功能,进一步验证其启动活性后可运用于玉米抗逆转基因研究。 相似文献
6.
通用型植物表达载体pCamE的构建及功能验证 总被引：2，自引：0，他引：2
为了探索通用型植物表达载体的快捷构建,本研究通过PCR克隆、酶切连接和PCR扩增获得CaMV 35S启动子序列及pUC19多克隆位点部分限制性内切酶位点和NOS终止子,构建成完整的表达组件,并将该组件插入pCAMBIA1300的多克隆位点,构建成通用型植物表达载体pCamE(GenBank登录号:JX841315)。pCamE表达组件的启动子上游、多克隆位点和终止子下游分别含有4、8和3个单拷贝限制性内切酶位点,利于外源基因的克隆和插入以及对载体启动子或终止子的修饰和更换。以绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,eGFP)为报告基因,分别构建了表达载体pCam::GFP、pCam::SalGFP和pCam::DAHPS-GFP,转化洋葱(Allium cepa L.)表皮细胞和拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),绿色荧光蛋白(GFP)和融合蛋白DAHPS-GFP在洋葱表皮细胞中均成功稳定表达;在pCam::GFP转基因拟南芥株系的根、根尖、根毛、茎表皮毛、幼叶基部、叶柄微管组织和未成熟花药等组织均能观察到强烈的绿色荧光。表明,植物表达载体pCamE是可将不同目的基因与植物染色体整合并稳定遗传的通用型植物表达载体,不受外源片段大小及插入位点的影响,具有经济实用、适用广泛、操作简便和外源基因在转基因植物中遗传稳定且正常表达等特点。该载体可用于不同基因和不同功能表达载体的快捷构建,为植物的遗传转化和基因功能研究提供了新的通用型基因表达载体工具。 相似文献
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玉米乙烯应答元件结合蛋白基因启动子克隆与功能验证 总被引：1，自引：1，他引：0
为了给玉米转基因研究提供更多的非生物逆境诱导启动子,寻找只在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆基因的表达,在生物信息学分析的基础上,克隆与水稻DREB1B转录因子基因同源的玉米乙烯应答元件结合蛋白基因sb CBF6的启动子psb CBF6,在非生物逆境应答元件分析和实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性后,用以构建驱动报告基因GUS的表达载体,并使用基因枪法转化玉米愈伤组织,通过愈伤组织的GUS荧光值与荧光素酶发光值的比值,评价psb CBF6启动子在非生物逆境胁迫及激素诱导条件下的驱动活性。结果表明,sb CBF6基因在各种非生物逆境胁迫下差异表达。psb CBF6启动子长1 479 bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,可在非生物胁迫条件下驱动外源抗逆基因在转基因植物中诱导表达。试验结果为研究抗逆转基因玉米提了供参考。 相似文献
8.
本研究通过PCR方法从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增出Oct4启动子的CR4区和CR1区,将其克隆到真核报告载体pEGFP-1,构建了携带Dct4启动子片段的小鼠生殖细胞特异性报告载体CR1,4-pEGFP-1.用该载体转染多种细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞中的表达情况,同时以半定量RT-PCR检测转染细胞中Oct4及其它生殖细胞特异性基因的转录情况.结果显示,GFP在小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和C2C12细胞中均不表达,而在P19细胞和睾丸细胞中表达.RT-PCR结果显示,Oct4在P19、睾丸细胞和生殖干细胞中特异性转录.这表明所构建的绿色荧光蛋白报告载体只在生殖细胞和多能生殖干细胞中内表达,该质粒可作为示踪生殖细胞的工具,同时也可以作为生殖干细胞多能性状态的一个监测标记. 相似文献
9.
pTet-on-Advanced双载体表达系统应用于转基因动物研制,需要建立两种动物品系,经过杂交和筛选,才有可能得到转基因个体,操作繁琐,转化效率低。本研究在改良的四环素(Tet-on)基因可调控系统基础上,通过PCR的方法,分别从pTet-on-Advanced质粒和pEGFP-N1质粒中扩增rtTA和EGFP基因,测序正确后,将rtTA和EGFP基因亚克隆入pTRE-Tight载体中,构建四环素pTRE-Tight-rtTA-EGFP单载体表达系统,然后采用脂质体法,将新构建的单载体表达体系pTRE-Tight-rtTA-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞,以不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1和1g/L)强力霉素(Dox)诱导,通过荧光显微镜检测EGFP的表达量。结果显示,转染48h后,未加Dox无绿色荧光表达;1g/LDos诱导可以观察到绿色荧光;Dox浓度分别为0.0001、0.001、0.01和0.1g/L未观察到绿色荧光。表明1g/LDox才能激发调控作用。本研究成功构建pTRE-Tight-rtTA-EGFP新型可控性真核表达载体,该载体在细胞中的表达受Dox的调控,能正常发挥作用。研究结果为转基因的定量表达提供了新的技术平台,也为将构建的单载体用于表达可控的转基因动物研究提供了重要科学依据。 相似文献
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Nramp1基因在猪肺泡巨噬细胞中具有较高的组织表达特异性,本研究的目的是克隆并分析猪(Sus scrofa)Nramp1基因在肺泡巨噬细胞中的特异性表达调控元件.本研究首先利用5'RACE技术确定了Nramp1基因转录起始位点,在此基础上构建了-1 327～+86 bp区域内不同长度的嵌套缺失片段,分别连接至pGL3-BASIC载体上,构建了pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274及pLUC179共8个缺失表达载体.采用脂质体转染法,与海肾荧光素酶载体共转染猪肺泡巨噬细胞、肾细胞、脂肪前体细胞和胎儿成纤维细胞,采用双荧光素酶报告系统验证了Nramp1基因不同启动子片段的表达活性,结果表明Nramp1基因核心启动子区位于-386～-173 bp.进一步比较了pLUC487[-386～+86]启动子区在巨噬细胞、猪肾细胞、脂肪细胞和胎儿成纤维细胞中的表达活性,结果表明Nramp1基因在巨噬细胞中的表达活性极显著地高于肾细胞、脂肪细胞和成纤维细胞(P<0.01),表明Nramp1基因启动子具有较高的巨噬细胞特异性.本研究获得了能够在猪肺泡巨噬细胞中特异表达的调控元件,为进一步实现外源基因在猪肺泡巨噬细胞中的特异性表达提供了基础. 相似文献
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利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。 相似文献
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肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。 相似文献
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鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要：为了实现外源基因在鸡(Gallus gallus )输卵管上皮细胞内的特异性分泌表达，采用RT-PCR的方法扩增了鸡溶菌酶基因的450 bp的cDNA片段，该片段保留了5ˊ端信号肽编码序列。将该片段插入到含有1.2 kb卵清蛋白5ˊ调控序列的特异性表达载体pOVA-GFP中，与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，使融合蛋白具有分泌功能。新构建的分泌表达载体pOVALG转染鸡胚成纤维细胞和大鼠乳腺上皮细胞系SHZ-88后，成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。 相似文献
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为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病毒对载体的重组病毒的免疫保护力,克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子,通过测序分析发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDVGA株序列的同源性为99.5%。分别以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和虫荧光素酶(luciferase)为报告基因,构建pSK-gB-LacZ和pgB-Luc真核表达载体。将pSK-gB-LacZ转染的中国地鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞进行染色,出现蓝色,说明在CHO细胞中,MDVgB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录。在CEF细胞中,利用虫荧光素酶系统将gB启动子与SV40及hCMV启动子进行活性比较,发现hCMV启动子的活性为gB启动子的31倍,SV40启动子为gB启动子的27倍。 相似文献
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本研究主要探讨转染方法对不同细胞系的转染效果。实验采用电穿孔和脂质体转染方法，将线性化的绵羊肌肉生长抑制素基因（myostatin）药物正负筛选（PNS）打靶载体pLoxp-1．4K-4．3KDNA导人体外培养的绵羊胎儿和成年绵羊耳部成纤维细胞中，而后采用G418和GANC进行药物抗性细胞克隆筛选和培养。结果发现，脂质体法对myostatin基因敲除载体的转染效果明显优于电击法，但电穿孔法对细胞类型的依赖性较小；采用与载体基因型相同的细胞系，两种转染方法的转染效率均略高于对照成年绵羊成纤维细胞系。 相似文献
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绿色荧光蛋白(GFP)是一种分选细胞的理想标记,将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛的Y染色体上是利用GFP分选X和Y精子的关键.本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增将loxp位点和Lox2272位点引入pEGFP-N3载体中,构建了重组质粒pEGFP-loxp-Lox2272.采用LipofectamineTM (Lip)2000介导线性化质粒p EGFP-loxp-Lox22 72转染牛胎儿成纤维细胞,结果显示,在质粒用量一定的情况下30μL Lip 2000转染细胞的效果最理想;转染后的牛胎儿成纤维细胞用G418筛选,结果显示,浓度为600μg/mL的G418最适合筛选转基因细胞.本实验的结果为载体改造提供了一种有效的方法并为牛体细胞基因打靶阳性细胞系的筛选提供了重要的技术参考. 相似文献
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脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是动物组织合成脂肪酸的关键酶,为研究奶牛(Bos taurus)FASN基因的调控机制,本研究从奶牛基因组DNA中克隆构建了3个不同片段长度的FASN基因启动子并分析其结构,在L02肝脏细胞中转染固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein1,SREBP1)真核表达载体和FASN启动子,Western blot检测SREBP1核蛋白的表达,双荧光素酶系统和q RT-PCR技术研究对FASN基因启动子活性的调控作用,结果发现,构建的pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子片段长度分别为177、255和399 bp,其中pGL3-FASN2和pGL3-FASN3包含SREBP1转录因子结合位点。在人(Homo sapiens)源L02肝脏细胞中转染SREBP1质粒后检测发现,SREBP1核蛋白表达升高。肝脏细胞中转染pGL3-FSAN1、pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子并用SREBP1质粒处理后,pGL3-FASN2和pGL3-FASN3启动子活性极显著增加(P0.01)。与对照组相比,SREBP1处理后细胞FASN基因m RNA的表达显著增加1.67倍(P0.05)。本研究揭示奶牛SREBP1蛋白可以促进对FASN基因的转录激活。这一结果为研究奶牛FASN基因的转录调控机制提供了基础资料。 相似文献
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真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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利用DNA同源重组(基因打靶)技术对动物基因组进行遗传修饰是转基因研究的重要手段之一。本研究以pEGFP-C1载体为载体骨架,成功构建了包含两个多克隆位点、两个同向LoxP(locus of crossing-over(x)in P1)序列和正负筛选标记基因的通用型打靶载体pGT-C1。正筛选标记新霉素磷酸转移酶基因(Neo)和水母绿色荧光蛋白基因(AcGFP)在两个LoxP序列之间;负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk和两个多克隆位点序列分别在两个LoxP序列外侧。经双酶切和测序证明载体构建成功后,转染胎牛成纤维(fetal bovine fibroblast,FBF)细胞,利用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)分别对正负筛选标记进行功能验证;随后将Cre重组酶表达载体转染阳性FBF细胞,用半定量PCR检测Cre-LoxP系统的切割效率;最后构建针对牛(Bos taurus)β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并在转染药筛后对其打靶功能进行检测。打靶载体pGT-C1具有以下优点:包含两个多克隆位点,方便长短同源臂的定向插入,极大提高了该载体的通用性;位于两个同向LoxP之间的绿色荧光标记基因AcGFP可实时监控载体的转染效率和整合效率,还能依据荧光表达筛选去除筛选标记的阳性细胞,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响,为高效基因打靶提供了保证。综上所述,本研究成功构建了更加实用、有效的通用型打靶载体pGT-C1,以及针对牛β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并成功获得了转基因牛成纤维细胞单克隆,为转基因动物模型的建立提供了基础工具。 相似文献
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表达外源绿荧光蛋白重组山羊痘病毒的构建及纯化 总被引：6，自引：0，他引：6
以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒 (Goatpox virus，GPV) 疫苗株为亲本，以复制非必需胸苷激酶 (tk) 基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂。利用转移载体pTK-lacZ-gfp及其与GPV发生同源重组获得的病毒(rGPV-lacZ-gfp) 验证外源基因β-半乳糖苷酶 (lacZ) 和绿荧光蛋白 (gfp) 基因在背靠背启动子p11和p7.5启动下成功稳定表达后，将转移载体lacZ基因更换为gpt (黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶) 基因 (pTK-gpt-gfp)，利用MPA阻断核酸代谢途径筛选并获得了遗传稳定表达的单一纯化病毒克隆 (rGPV-gpt-gfp)。研究建立了表达外源基因重组GPV构建系统及其克隆纯化方法，为进一步开展GPV活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。 相似文献