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猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
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将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构基因ApxⅡA克隆到原核表达载体pGEX-6P-1，并在大肠埃希氏菌中进行了表达，表达产物rApxⅡA以包涵体形式存在。为了检测rApxⅡA的免疫原性，分别用rApxⅡA、灭活疫苗以及灭活疫苗添加rApxⅡA对比利时白兔进行了免疫。免疫后进行攻毒，所用菌株分别为同型菌株（APP7型L25—4株）和异型菌株（APP1型4074株）。结果，免疫动物对相同血清型菌株的攻击获得完全保护，且对异型菌的攻击也获得一定保护作用。表明，rApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性，作为抗原成分添加到灭活疫苗中后可提高灭活疫苗的免疫效果。 相似文献
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胸膜肺炎放线杆菌apxⅡCA基因的克隆、表达及ApxⅡ-ELISA检测方法的初步建立 总被引：4，自引：2，他引：4
根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌 (APP) Apx 的基因序列设计了 1对引物 ,从我国 APP武汉株扩增出约3.5 kb的 apx CA基因。测序结果表明 ,该基因的大小与国外已报道的 1型和 9型 APP的 apx CA基因大小一致 ,同源性达 99%。将该基因连接到原核表达载体 p ET- 17b,构建了原核表达质粒 p ET- apx CA,并在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中表达出了大小约 10 5 0 0 0的 Apx 蛋白。提取包涵体蛋白作为抗原包被 EL ISA酶标板 ,对已知阳性、阴性血清和临床送检血清样品进行了 EL ISA检测 ,从而为最终建立 Apx - EL ISA检测方法奠定了基础 相似文献
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为了深入地了解胸膜肺炎放线杆菌（APP）分泌的ApxⅡ毒素的分子结构及序列特征，本实验以一株APP7型现地分离株L25-4株为实验材料，对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA及其上游启动子区进行了PCR扩增和测序。结果表明APP7型L25-4株apxⅡA基因与其它血清型apxⅡA基因核苷酸序列同源性达99．5％以上，氨基酸序列同源性达98．5％以上。在ApxⅡA蛋白的N末端有3个大的疏水结构域，分布在240422位氨基酸之间。在ApxⅡA蛋白的C末端有富含甘氨酸（Gly）和天门冬氨酸（Asp）的九肽（nonapeptides）重复序列Leu／I1e／Phe-Xaa-Gly—Gly-Xaa-Gly-Asm／Ssp-Asp-Xaa，串连重复9次。这些结构域的起始氨基酸的位置分别为374、503、630、735、753、762、771、780和802。推定的赖氨酸酰基化作用位点为557位氨基酸，与E．coil的H1yA相比，在688位氨基酸处少了一个赖氨酸酰基化作用位点。apxⅡA基因启动子-10区序列为AATAAT，-35区序列为TTAAT，-10区与-35区间隔序列为11个碱基。 相似文献
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为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的诊断方法，本研究在对APP的RTX毒素(ApxⅠ～Ⅲ)生物学信息分析的基础上，以APP血清5型和8型的DNA为模板对ApxⅠ～Ⅲ分段扩增后进行截短表达，获得12个截短表达蛋白。利用Western blot对12个表达蛋白进行抗原性分析，确定ApxⅠ～Ⅲ的优势抗原决定簇分别为蛋白AⅠ2、AⅡ3和AⅢ2。以蛋白AⅡ3、AⅢ2、AⅠ2的顺序排列并在蛋白间加入GPGPG氨基酸序列，无缝克隆3个蛋白片段基因，通过原核表达获得融合蛋白A231。该蛋白可与临床APP阳性猪血清特异性结合，具有良好的免疫反应性。该研究的成功开展可为研制具有交叉保护力的亚单位疫苗及建立配套ELISA检测方法奠定基础。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(App)引起的猪的一种呼吸道传染病.到目前为止,APP已经被分离鉴定出了15种血清型(1～15).15种血清型的APP能产生属于RTX毒素家族的4种Apx毒素,分别为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ.ApxⅠ操纵子包含有ApxⅠ C、A、B、D 4个基因;ApxⅠ毒素含有13个富含甘氨酸的重复区.ApxⅡ操纵子仅包括结构基因ApxⅡA和激活基因ApxⅡC,而无分泌基因;ApxⅡ蛋白含有8个甘氨酸的序列重复.ApxⅢ操纵子与ApxⅠ操纵子相同,具有一个完整的操纵子;ApxⅢ在N～末端有3个疏水区,在C末端部分有13个富含甘氨酸的区域.Apx毒素的致病机理为先由没有活性的前体蛋白转变为有活性的ApxA蛋白,再由有活性的ApxA蛋白侵害细胞. 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究 总被引：8，自引：2，他引：8
利用大肠杆菌表达猪胸膜肺炎放线杆菌的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ，提取表达产物包涵体，再加入我国流行的猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌，和等量弗氏佐剂乳化后制成亚单位菌苗，免疫BALB／c小鼠，间隔2周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素I、Ⅱ、Ⅲ的EuSA抗体和7型菌的血凝抗体，第2次免疫2周后用5LDso的猪胸膜肺炎放线杆菌1型、7型菌株进行攻毒。结果发现第2次免疫后抗体水平显著升高，用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为83．3％和91．7％，从死亡小鼠的体内分离到了攻毒菌株，初步的动物试验表明此种新型亚单位菌苗对同型和异型的APP菌株具有较好的保护力，为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。 相似文献
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溶血外毒素（Apx）是胸膜肺炎放线杆菌（APP）最主要的毒力因子及保护性抗原。利用PCR技术扩增APP血清5型编码APXIN一端具有保护性抗原表位的APXIA部分基因,扩增片段长度为1149bp。将其插入原核表达载体PET-32a中,转化至E．coilBL21中诱导表达。SDSPAGE分析结果表明APXIA基因能在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白的分子量约为40ku。Western-blot结果表明该融合蛋白能被APP阳性猪血清所识别,指示表达的蛋白具有良好的免疫活性,为建立猪传染性胸膜肺炎的诊治及高效亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达 总被引：2，自引：1，他引：1
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。 相似文献
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参照猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）ApxⅣ基因序列（AF021919）,从临床分离株2009JH扩增出1段2 427bp的序列,应用DNAstar等软件进行了序列分析和抗原表位的预测,利用PCR扩增了包含预测抗原位点的3个片段,ApxⅣ1（1～1 503bp）、ApxⅣ2（1 051～2 427bp）、ApxⅣ3（1 051～1 503bp）,并构建了原核表达载体pET-ApxⅣ1,pET-ApxⅣ2,pET-ApxⅣ3。将重组表达质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot检测。结果显示,2009JH分离株ApxⅣN端序列与参考序列（AF021919）的同源性为98.00%,与血清1型、2型和7型的同源性分别为98.23%,99.46%,98.06%。3个片段的重组质粒分别诱导表达出相对分子质量为55 000,50 000,20 000的蛋白,Western blot检测显示除20 000蛋白未检测到特异性条带外,其余有很好的反应原性。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2019,(8)
为研制以胸膜肺炎放线杆菌(APP) 4种外毒素蛋白(ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA)和外膜蛋白(OMP)为组分的亚单位疫苗,在本研究室已表达纯化的r ApxⅠA、r ApxⅡA、r OMP的基础上,本研究通过PCR扩增得到ApxⅢA、ApxⅣA基因,并分别将其克隆至表达载体p ET-32a中,测序验证后将重组质粒转化入宿主菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后获得重组蛋白r ApxⅢA和r ApxⅣA。将获得的5种蛋白(rApxⅠA、r ApxⅡA、r ApxⅢA、r ApxⅣA和r OMP)按一定比例混合制备成亚单位疫苗免疫BALB/c雌鼠进行免疫效果测定,设灭活疫苗组(Ⅰ组)、弗氏佐剂乳化的亚单位疫苗组(Ⅱ组)、白油佐剂乳化的亚单位疫苗组(Ⅲ组)、灭活疫苗+白油佐剂乳化的亚单位疫苗组(Ⅳ组)和PBS组(Ⅴ组)。Western blot结果显示,表达了重组蛋白r ApxⅢA和r ApxⅣA且具有较好的反应原性;抗体检测结果显示,加强免疫后,Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组的r ApxⅠA、r ApxⅢA、r ApxⅣA和r OMP抗体水平基本一致(p0.05),均显著高于Ⅴ组和Ⅰ组(p0.05);攻毒保护试验结果显示,Ⅱ组与Ⅲ组保护率一致(p0.05),显著高于Ⅴ组(p0.05)。表明本研究中的亚单位疫苗具有一定的免疫保护效果,为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达 总被引：6，自引：1，他引：6
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引：4，自引：3，他引：4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清7型25-4株基因组DNA为模板，用PCR扩增外膜蛋白（OMP）基因特异片段，并克隆于pMD18-T中，经酶切及核苷酸序列分析鉴定后，亚克隆于原核表达栽体pGEX-6P-1，成功构建了重组表达载体pGEX-omp；以此转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），经SDS-PAGE鉴定，表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku，命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解，获得切掉标签的OMP。经ELISA检测，该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应，具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APP OMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。 相似文献
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以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。 相似文献
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为鉴定胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）ApxIA毒素蛋白N端疏水区和C端Ca^2＋结合区的免疫原性，参照apxIA基因序列（D16582）设计4条引物，用于扩增APP血清10型参考菌株（D13039）基因组DNA中长约3．2kb的apxIA基因及其N端（1．4kb）和C端（1．8kb）基因片段，经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达，表达的融合蛋白大小分别约为125Ku、65Ku和80Ku。表达产物免疫小鼠后的攻毒保护试验结果显示，ApxIA表达蛋白对APP血清10型（D13039）攻毒可提供完全保护，而对APP血清1型（4074）攻毒仅能提供部分保护，与提纯的Apx1毒素蛋白免疫保护效果相当；ApxIA-N端表达蛋白免疫保护活性显著高于ApxIA-C端表达蛋白，提示ApxIA蛋白免疫活性位点多位于N端，在Apx1毒素蛋白的保护性抗原活性中发挥更重要作用。 相似文献