共查询到20条相似文献，搜索用时 328 毫秒
1.
为建立一种用SYBR Green I荧光染料检测PK 15细胞α干扰素(α IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法，通过在猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）抑制α IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。根据GenBank中目的基因的序列，利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物。利用TRIzol法提取总RNA，经Oligo d(T)15进行反转录，利用PCR扩增各段目的基因，并克隆至pMD 18 T载体，转化大肠杆菌DH 5α，经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线，并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时qPCR方法，检测PCV2对α IFN效应因子的抑制效果。对建立的PK 15细胞α IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析，结果表明Mx1、OAS和内参β actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL的范围分别呈良好的线性关系。PK 15细胞在接种PCV2，并受到α IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低。本试验建立了PK 15细胞α IFN效应因子的qPCR检测方法，为在mRNA水平上对PK 15细胞α IFN效应因子的定量分析奠定了基础，并成功地初步应用于PCV2抑制α IFN发挥效应的信号通路研究中。 相似文献
2.
《动物医学进展》2015,(10)
为建立膜连蛋白A2(AnxA2)基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank中公布的AnxA2基因序列设计并合成引物,经过条件优化,建立了AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0.999;灵敏性好,比普通PCR灵敏100倍。应用建立的方法对随机选取的几种哺乳动物细胞进行检测。结果表明,建立的方法能成功检出不同细胞中AnxA2含量。表明本研究建立的AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏性高,重复性好,可用于AnxA2的检测及定量分析。 相似文献
3.
《四川畜牧兽医》2021,(2)
为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法线性关系良好,重复性好,扩增效率高,无引物二聚体和非特异性扩增,最低检测限为2.13×101copies/μL,比普通PCR高出1 000倍,该方法对绵羊羊痘病毒和山羊痘病毒的核酸cDNA不检出,特异性好;对180份山羊全血样本进行ORFV检测,结果得出常规PCR阳性检出率为2.8%(5/180),荧光定量PCR阳性检出率为4.4%(8/180)。试验表明,本次建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,适用于羊口疮病毒临床样本的检测。 相似文献
4.
据猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）S基因序列设计1对特异性引物,通过对实时荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法,同时对12份病料进行检测,并与常规RT-PCR进行比较。结果显示,该方法的敏感性达到43.07拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性,而常规RT-PCR最低只检测到4.307×103 拷贝/μL,敏感性较低。本试验建立的检测TGEV S基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法为传染性胃肠炎的鉴别诊断及TGEV的分离鉴定奠定了技术基础。 相似文献
5.
为探讨羊痘病毒感染后机体的凋亡细胞因子mRNA表达水平的变化,深入探讨羊痘病毒免疫机制,本研究设计针对羊凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α特异性引物,建立羊凋亡细胞因子实时荧光定量方法。分别建立荧光定量PCR反应体系并进行优化。结果表明:Fas、FasL、TNFR1和TNF-α的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰。组内变异系数均小于2.00%。本研究建立的羊凋亡细胞因子SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法为凋亡细胞因子mRNA表达水平提供了技术平台。 相似文献
6.
《中国兽医杂志》2019,(1)
根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R~2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。 相似文献
7.
8.
《畜牧兽医学报》2020,(2)
为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL~(-1),其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00。应用该方法检测了2018—2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。 相似文献
9.
为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对口蹄疫病毒（FMDV）2B基因的抑制作用,针对WFL株FMDV的2B基因,设计了4个siRNA,并将shRNA表达模板插入pSilencer1.0-U6载体,构建shRNA表达质粒,将其与含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP＋2B融合表达质粒瞬时共转染BHK-21细胞,以荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光表达量的变化,以实时定量RT-PCR法检测对2B基因mRNA的抑制作用。结果表明,本试验所构建的针对2B基因的shRNA表达载体可以在BHK-21细胞中抑制2B基因的瞬时表达。 相似文献
10.
根据Gen Bank登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株（登录号KJ960180）的M基因保守序列,设计1对扩增片段大小为299 bp的特异性引物,经PCR扩增、克隆、测序鉴定后,提取质粒作为阳性标准品,建立了PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在1.21×10^3~1.21×10^8拷贝/μL范围内呈现良好的线性,相关系数（R2）为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线为单个特异峰,产物Tm值为85.5~86℃,最低检测限为1.21×10^1拷贝/μL。本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、成本低且操作简单,适用于PEDV的早期诊断、定量研究和流行病学监测。 相似文献
11.
12.
为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,本实验分别采用IBDV弱毒感染DT40细胞和强毒感染SPF鸡,以荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的m RNA转录变化。在IBDV感染DT40细胞的2 h到24 h内,ch MDA5、ch TLR3、ch LGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx的转录水平显著上升,分别为324、22、61、29、16、225 000和18 700倍。当采用si RNA分别敲除DT40细胞中ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2时,IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2 h到24 h差异变化不显著。在IBDV感染SPF鸡法氏囊组织细胞中,ch MDA5和ch TLR3的表达显著降低,而ch LGP2表达无显著差异,IRF3、PKR、OAS和Mx的转录水平显著上升。TLR4和TLR7在IBDV的体外和体内感染试验中均未检测到,而IPS-1在IBDV的体外和体内感染试验中均变化不显著。本实验结果表明,ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2在识别IBDV的感染中起着关键作用,IBDV感染严重抑制了PRRS ch MDA5和ch TLR3的转录,并且提示其抑制作用在体内与体外可能存在不同的分子机制。 相似文献
13.
为了解鸡干扰素刺激基因(ISG)在鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染雏鸡气管黏膜中的表达情况,采用实时荧光定量PCR检测IBV M41株感染SPF鸡后不同时相气管黏膜中β干扰素(IFN-β)和干扰素刺激基因mRNA转录水平和IBV病毒载量变化。结果显示,鸡气管黏膜中IFN-β和干扰素刺激基因Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5mRNA转录水平在感染后(DPI)第1~14天显著(P0.05)或极显著(P0.01)上调,且均在5DPI达到峰值;鸡气管黏膜中IBV病毒载量在1DPI急剧升高,在5DPI达到峰值,14DPI病毒载量急剧下降。结果表明,IFN-β、干扰素刺激基因Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5mRNA转录水平与IBV病毒载量变化趋势一致,提示IFN-β、干扰素刺激基因Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3和IFIT5在抵御IBV入侵、抑制IBV复制、增殖以及病毒清除中发挥重要作用。试验结果丰富了宿主抗IBV感染的固有免疫应答机制,为IBV感染的预防和控制提供了理论依据。 相似文献
14.
用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。 相似文献
15.
为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。 相似文献
16.
为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL-1,其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R2=1.00。应用该方法检测了2018-2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。 相似文献
17.
根据猪源干扰素刺激基因PPBP(pro-platelet basic protein)基因全长序列,使用引物设计软件Primer Premier5.0设计合成特异性引物,经过PCR扩增,将基因扩增的片段连接到相应的载体上,成功构建重组质粒p3XFLAG-CMV-7.1-PPBP。重组质粒经过筛选、鉴定以及纯化后,经10倍系列稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中PPBP标准曲线的构建,并检测重复性、灵敏性和特异性。结果显示标准曲线线性关系R20.99;特异性试验中也能检测到PPBP扩增曲线;组间和组内变异系数均小于5%。使用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测PRRSV感染组织和未感染组织中PPBP的表达情况,能够检测出组织中PPBP的含量存在差异。本研究初步建立了检测猪PPBP基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为后续猪传染性疾病和猪PPBP之间相互关系的研究提供一个特异灵敏的检测和手段。 相似文献
18.
采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×109~8.80×101 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×101 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。 相似文献
19.
参照猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了1对引物，分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板，采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，确定特异性产物的Tm值，同时做普通PCR。试验结果表明，特异性产物的Tm值为88．5℃，最低能检测到含0．036fg／μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性，为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。 相似文献
20.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。 相似文献