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《畜牧与兽医》2021,(7)
为了有效分离纯化绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞,为绵羊早期胚胎附植相关研究提供可靠的体外细胞模型,本试验采用组织块培养法分离培养子宫内膜上皮和基质细胞,利用胰酶差时消化法对2种细胞进行纯化,通过免疫荧光法对上皮细胞和基质细胞的特异性表达蛋白角蛋白18(CK18)和波形蛋白分别进行鉴定。结果显示,利用组织块法第3天开始有细胞从组织块中爬出,5～6 d单层细胞铺开,显微镜下观察细胞形态呈梭形和铺路石状,2种细胞交织在一起生长。使用0.25%胰蛋白酶消化细胞时,基质细胞约90 s变圆有脱落,而上皮细胞则需要6 min变圆有脱落。免疫荧光鉴定结果显示上皮细胞呈角蛋白阳性,波形蛋白染色阴性,阳性率大于95%。基质细胞呈波形蛋白阳性,角蛋白阴性,阳性率大于95%。研究结果表明,采用组织块培养法结合胰酶差时消化法可成功分离得到纯度较高的绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞,为绵羊胚胎附植过程中子宫内膜细胞的相关生物学功能研究奠定基础。 相似文献
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奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定 总被引：4，自引：0，他引：4
《动物营养学报》2015,(8)
本试验旨在培养功能性奶牛乳腺上皮细胞系,为奶牛泌乳调控和奶牛乳房炎发病机制研究提供功能性的细胞模型。采用组织块细胞培养法来分离纯化并鉴定奶牛乳腺上皮细胞;采用有限稀释法单克隆奶牛乳腺上皮细胞;采用噻唑蓝(MTT)法来分析奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线是否为正常的"S"形;观察细胞角蛋白18免疫荧光来证明所培养的细胞为上皮型;选择培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞进行染色体核型分析。结果表明:1)利用组织块细胞分离法能够成功获得奶牛乳腺上皮细胞并传至20代。2)培养5~6 d成纤维细胞迅速增殖且周围分裂出少量的上皮细胞。培养8 d奶牛乳腺上皮细胞迅速增殖,形成岛屿状集落,呈单层"鹅卵石"和"铺路石"形态生长。3)奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18鉴定为阳性。4)培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞染色体数为60条,具有正常的细胞二倍体核型。综上所述,采用组织块培养细胞能够获得具有稳定性、功能性的奶牛乳腺上皮细胞,但不是永生化细胞。 相似文献
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奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好. 相似文献
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《畜牧与兽医》2016,(7):83-88
为建立一种经济、简便的分离纯化培养绵羊子宫内膜上皮细胞及基质细胞的方法,采用传统组织块培养法、胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶消化+组织块培养法,分别对绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞进行了原代培养比较研究。结果表明:3种方法均可以获得原代绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞。混合生长的细胞经胰蛋白酶差时消化可获得较纯上皮细胞和基质细胞,且其生长曲线均呈S型。经比较分析,胰蛋白酶消化+组织块培养法为最佳培养方法,操作简便、经济实用,获得的绵羊子宫内膜上皮细胞呈铺路石状可传3代,角蛋白18免疫细胞化学染色阳性,纯度达90%以上;基质细胞呈长梭形、漩涡状生长可有限传代,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,纯度达95%以上。 相似文献
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目的：建立荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法。方法：采用组织块种植法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用胰蛋白酶差时消化法分离、纯化上皮细胞。结果：成功培养出奶牛乳腺上皮细胞,显微镜下观察,纯化的乳腺上皮细胞呈典型上皮细胞形态,细胞之间排列紧密,呈鹅卵石铺路样,形态均一,多角形的单层聚集。通过荧光免疫细胞染色方法对细胞骨架蛋白-角蛋白18进行鉴定,呈现阳性反应。乳腺上皮细胞增殖旺盛,经25次以上传代后长势仍然良好。结论：采用组织块种植法结合胰酶差时消化法成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。 相似文献
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奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞的分离、培养及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞,给建立奶牛子宫内膜体外模型提供条件,研究采用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离细胞,随后传代培养纯化细胞,并通过光镜观察和免疫细胞化学染色对其进行鉴别.结果表明:0.3%胰蛋白酶消化组织块1 h后可得到上皮细胞,纯度＞80%;上皮细胞呈多边型,核大而圆,具有细胞角蛋白免疫反应性.用0.1%胶原酶Ⅱ继续消化2 h,可得到间质细胞,纯度＞90%;间质细胞贴壁后可见梭形和多角形两种形态,免疫细胞化学染色显示这两种细胞均具有波形蛋白免疫反应性,而细胞角蛋白无免疫反应性,提示它们为来源于内膜基质的基质细胞,说明采用酶消化法能够成功地培养奶牛子宫内膜间质细胞和上皮细胞. 相似文献
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猪乳腺细胞分离培养及EGFP基因转化 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞.利用乳腺细胞堵养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞.结果,从成年猪乳腺组织中成功分离培养出上皮细胞和成纤维细胞,获得转EGFP基因上皮细胞和成纤维细胞.上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚,比较明显.成纤维细胞呈长梭形.结果表明,可以从猪乳腺组织中分离上皮细胞和成纤维细胞,EGFP可以在这些细胞中表达. 相似文献
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《动物医学进展》2015,(12)
为建立小鼠乳腺上皮细胞(MMECs)及奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)分离培养体系,并比较其生长特性。分别无菌采集健康妊娠后期昆明鼠及泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺组织,采用改良混合酶消化结合差速贴壁法分离原代MMECs及BMECs,并进行细胞角蛋白18的免疫荧光鉴定;通过细胞形态跟踪观察评价传代、冻存和复苏后MMECs及BMECs生物学特性;连续培养及细胞计数绘制MMECs及BMECs生长曲线。结果显示,从小鼠和奶牛乳腺组织分离的目的细胞,经角蛋白18免疫荧光鉴定证实为MMECs及BMECs;汇合的单层MMECs多角形,呈铺路石样外观,BMECs呈鹅卵石样;MMECs在传至第2代时细胞特有形状消失,而BMECs传至第9代时仍保持其鹅卵石样外观;MMECs只能复苏冻存原代细胞,传代BMECs均可冻存和复苏。采用改良混合酶消化结合差速贴壁法可获得高纯度的MMECs和BMECs,两种细胞在生长培养特性上存在显著差异。 相似文献
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通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的＂S＂型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。 相似文献
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S Tateyama A Takeshita D Nosaka R Yamaguchi N Miyoshi F Kondo 《Nippon juigaku zasshi. The Japanese journal of veterinary science》1990,52(1):137-143
To study the growth and morphology of feline mammary epithelial cells in vitro, normal feline mammary tissues as well as cells collected from feline milk were cultured and examined using phase-contrast microscopy and immunohistochemistry. The method employed was a modification of Hiratsuka et al., and was found to be useful for the culture of dissociated feline mammary tissue. Small polygonal cells and large spindle-shaped cells that were positively stained with anti-keratin and anti-actin antibodies formed colonies with a pavement-like structure in culture of mid-pregnant mammary gland. Cultures of involuting mammary gland were composed mainly of small spindle-shaped cells, which were negative for keratin immunostaining and thought to be fibroblasts. Myofibroblasts, which participate in feline mammary carcinogenesis, and show keratin negative, actin positive, were not encountered in the present culture system of normal mammary gland. The cells from milk formed small colonies, but did not grow to reach confluent monolayer. 相似文献
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Insulin and insulin-like growth factor-I stimulate DNA synthesis in bovine mammary tissue in vitro 总被引：2，自引：0，他引：2
Effects of insulin and insulin-like growth factor I (IGF-I) on [3H]thymidine incorporation, in vitro, by mammary tissue slices obtained from prepartum and lactating cows were investigated. Both insulin and IGF-I induced up to a 10-fold increase in [3H]thymidine incorporation in the mammary slices cultured in serum-free media. The effect of insulin-stimulated [3H]thymidine incorporation occurred at a threshold of greater than 1.75 pmol/ml and appeared to reach maximum at greater than 8.8 nmol/ml. The response to IGF-I occurred at greater than 6.5 pmol/ml and reached the equivalent of maximal insulin-stimulated incorporation at 39 pmol/ml. No synergistic or additive effects were observed between these two factors. The in vitro response took 3 to 4 d to reach maximum and was inhibited by cytarabine. Mammary tissue obtained from lactating cows incorporated more [3H]thymidine per microgram DNA in response to insulin (175 pmol/ml) than mammary tissue from pregnant cows. Culture of mammary tissue slices with growth hormone, cortisol, prolactin, or triiodothyronine showed no stimulation of [3H]thymidine incorporation over control. Autoradiography of the cultured lactating tissue showed incorporation of [3H]thymidine by 51, 24 and 29% of the ductal epithelial, secretory alveolar epithelial and myoepithelial cells, respectively. All alveolar epithelial cells that incorporated [3H]thymidine contained secretory products. Among nonsecretory cells, 25 and 28% of the fibroblasts and white blood cells, respectively, were labeled. Insulin-like growth factor I, but not bovine somatotropin, stimulated [3H]thymidine uptake into DNA in lactating bovine mammary tissue. Thus, our data support the concept that bovine somatotropin acts through IGF-I to increase DNA synthesis in mammary cells. 相似文献
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从健康奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过添加两种不同的培养液来分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果。结果表明,使用组织块接种可以得到大量细胞用于体外培养。在以DMEM/F12为基础的普通培养液中进行乳腺上皮细胞体外培养,原代细胞生长较慢,细胞形态不典型。而添加表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松所组成的完全培养液中,奶牛乳腺上皮细胞生长良好。并通过细胞形态学观察,细胞染色体核型分析,荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白K14,K15。结果表明,分离培养的细胞是牛乳腺上皮细胞。 相似文献
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试验旨在研究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cell, BMEC）中NFκB1的表达与定位变化,以阐明NFκB1对BMEC乳合成的转录调节机理。通过组织块法培养原代细胞,利用BMEC和成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性的不同进行纯化和传代;利用Western blotting和免疫荧光染色法检测细胞中角蛋白18和β-酪蛋白的表达以鉴定细胞的纯度和泌乳功能;通过添加0.6 mmol/L蛋氨酸建立氨基酸刺激BMEC泌乳的体外模型;Western blotting和免疫荧光法检测添加蛋氨酸后NFκB1和p-NFκB1表达与定位的变化。结果显示,获得了纯化的BMEC;Western blotting检测发现NFκB1在细胞浆中存在约141和105 ku两种形式,在细胞核中只存在105 ku形式;p-NFκB1（50 ku）主要存在于细胞核内。在添加蛋氨酸后NFκB1的141 ku形式的含量有一定增加;105 ku形式在细胞浆内蛋白水平变化不明显,在细胞核内水平明显升高;p-NFκB1在细胞核中的定位明显增加。结果提示,NFκB1参与BMEC乳合成的转录调节,氨基酸通过促进细胞核内NFκB1磷酸化以调节泌乳相关基因的转录和促进乳合成。 相似文献
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奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及其生物学特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在从奶牛乳腺组织中分离原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）并传代培养后探究其生物学特性。本研究从屠宰场采集健康泌乳奶牛乳腺并采用改进的酶消化法从乳腺中分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学观察、免疫荧光以及染色体核型分析的方法对其进行鉴定。同时,研究第3、第6和第9代乳腺上皮细胞的生长曲线、群体倍增时间和冻存复苏活力,检测不同代次细胞分泌乳蛋白、乳脂、乳糖的功能及泌乳相关基因的表达。结果表明,所分离的奶牛乳腺上皮细胞纯度较好,细胞生长呈现S型,3个代次细胞的群体倍增时间依次为34.87、41.45和65.04 h,冻存复苏活力为88%~93%;在细胞分泌功能方面,诱导培养2 d后均能检测到酪蛋白、甘油三酯和乳糖,且各代次间无显著差异;此外,3个代次的细胞诱导后均能表达乳成分合成相关基因。本研究成功培养了原代奶牛乳腺上皮细胞,并证明直到第9代细胞仍然具有正常的生物学功能,为体外探究乳腺细胞增殖与分化机制提供了良好的试验材料和技术支撑。 相似文献
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