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1.
利用基因工程技术构建的带有K_(99)和F_(41)两种纤毛抗原基因的重组质粒与K_(88)抗原工程菌C_(84)的质粒转化同一受体菌,得到双质粒。同时表达K_(88)、K_(99)、F_(41)三种纤毛抗原的菌株。用小白鼠试验初步证实。该菌株生物学性质稳定,对动物安全,对K_(88)、K_(99)和F_(41)强毒菌的攻击具有较强的保护作用。 相似文献
2.
应用转化法:将带有K_99纤毛抗原的重组质粒PHK_99分别转化到具有K_88纤毛抗原的产肠毒素菌株B_6(O_149K_91K_(68)ac)“和不具K_88抗原的产肠毒素菌株(O_14K_85),获得了35株抗氨苄青霉素的转化子。在这35个转化子中,有32个能同时表达K_(88)、K_(99)两种纤毛抗原,有3株能表达K_(99)纤毛抗原。这些转化子仍具有产肠毒素的特性。 相似文献
3.
K_(88)K_(99)双价基因工程菌,是一株人工构建的无肠毒素基因、丧失了病原性但仍保留产生 K_(88)、K_(99)两种保护性抗原基因的菌株,它具有优良的免疫原性和相当良好的安全性、稳定性,具备用于制备无毒活菌苗的良好条件。因此,我们在研究菌苗的工艺路 相似文献
4.
大肠杆菌肠毒素ST1b基因的亚克隆及其核苷酸序列分析 总被引：3，自引：1，他引：2
以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。 相似文献
5.
引起仔猪黄痢、白痢的埃希氏大肠杆菌荚膜抗原主要有K_(88)、K_(99)、987P、F_(41)四种,而K_(88)、K_(99)抗原型的大肠杆菌最为常见,也是引起仔猪黄、白痢主要血清型的大肠杆菌.为了探讨大肠杆菌K_(88)、K_(99)双价基因工程冻干菌和抗痢宝对仔猪黄、白痢病预防效果,作了本试验. 相似文献
6.
应用细菌质粒转化技术,将大肠杆菌K_(?)与LT(A~-B~ )抗原基因重组质粒转入猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株中.对获得的其中8个转化子进行鉴定的结果表明,转化的细菌仍保持沙门氏菌的形态、生化及抗原特性,同时可稳定地表达K(?)和LT-B两种抗原.用微量间接血凝试验、抗甘露糖豚鼠红细胞凝集试验(MRHA)、ELISA等对转化菌表达的K(?)抗原进行了测定,用间接免疫溶血试验对其表达的LT-B抗原进行了测定.结果,这两种抗原在转化的细菌中均可高效表达.电镜下观察,转化的细菌在其表面形成菌毛样结构.这种转化细菌表现出猪霍乱沙门氏菌与产肠毒素性大肠杆菌的两种抗原特性,为这种双价工程菌苗的研制提供了有价值的候选菌株.本研究结果还表明,猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株可作为基因转化的有效受体菌. 相似文献
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《上海畜牧兽医通讯》2016,(2)
以构建好的O型FMDV VP1基因的重组质粒PMD18-T-VP1为模板,通过PCR扩增出VP1基因主要抗原位点VP1(61~180bp)的核苷酸及VP1(421~639bp)的核苷酸,采用重组PCR方法将扩增所得的2个基因片段用linker连接,结果构建出1个含384bp的重组质粒,将该重组质粒定向插入原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了pGEX-6P-1-VP1(384bp)串联表达载体。该串联表达载体的构建为进一步研制FMDV的诊断抗原及多肽疫苗奠定了基础。 相似文献
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产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达 总被引：4，自引：0，他引：4
应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。 相似文献
9.
运用生物信息学技术推测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)变异株(793/B)M基因的抗原位点,应用DNAStar软件针对M基因及其抗原表位片段设计3对引物,PCR扩增并成功构建了M基因的pGEX6p-M和2种截短M基因的pGEX6p-M1,pGEX6p-M2原核表达质粒,SDS-PAGE检测分别在50000,32000,29000处有特异性表达条带,表明GST-M,GST-M1,GST-M2重组蛋白获得成功表达;Westernblotting检测显示,GST-M和GST-M1重组蛋白能被鼠抗IBV(793/B)血清识别,而GST-M2重组蛋白不能被识别。GST-M与GST-M1重组蛋白具有良好的抗原性,初步证实M蛋白存在抗原表位,这为进一步研究IBV(793/B)M蛋白的免疫原性和制备基因工程疫苗提供了重要依据。 相似文献
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11.
为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位基因5epis的免疫效力,本研究应用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,构建基于HBcAg修饰基因(mHBc)的抗原表位嵌合体基因分子载体pET-mHBc。将编码IBDV多表位基因5epis定向插入到pET-mHBc的mHBc基因中,获得嵌合体基因mHBc-5epis表达重组质粒pET-mHBc-5epis,并在大肠杆菌中表达。经SDS-PAGE分析,重组嵌合体蛋白的分子量约29 ku,表达量约占菌体总蛋白的47.6%;Western blot结果表明,重组嵌合体蛋白可与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带;重组嵌合体蛋白呈病毒样颗粒(VLP),直径约100 nm～120 nm;用IBDV抗体夹心ELISA检测,抗原效价达到1∶200。本实验成功构建了5epis与HBcAg嵌合体基因,并在大肠杆菌中高效表达,具有IBDV抗原反应性的重组病毒样颗粒嵌合体蛋白,为研究其表位型基因工程疫苗提供了新途径。 相似文献
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采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(ST Ⅰ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将ST Ⅰ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达栽体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别. 相似文献
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大肠杆菌定居因子K_(88)抗原ELISA检测法 总被引：2，自引：0，他引：2
本文报告用ELISA双抗体夹心法检测大肠杆菌定居因子K_(88)抗原。K_(88)大质粒转化子和K_(88)基因重组子。结果说明此法灵敏度较高,特异性较好,可直接检测菌液,有快速、简便的优点,可以作为检测k_(88)基因克隆是否表达的一种筛选方法,亦可考应虑用于大肠杆菌k_(88)菌株的检测。 相似文献
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口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达 总被引：5，自引：1，他引：4
将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China／99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59．1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31．4％。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。 相似文献
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应用Sj23基因重组抗原诊断牛、羊血吸虫病研究 总被引：3，自引：0，他引：3
以血吸虫基因重组抗原LHD-Sj23／pGEX(血吸虫23kD抗原大亲水区多肽／pGEX载体表达蛋白)作为抗原。应用ELISA法检测黄、水牛和绵羊血吸虫病。结果对黄、水牛的阳性符合率为94．0％(79／84)和85．5％(53／62)，阴性符合率为82．7％(81／98)和95．1％(77／81)，对绵羊的阳性符合率为86．04％(111／129)，阴性符合率为100％(9l／91)。以血吸虫成虫抗原(SWAP)及虫卵抗原(SEA)作为诊断抗原获得的结果差异不明显。对锥虫感染绵羊血清不出现交叉反应。由于基因重组抗原的制备比虫体抗原制备简便、价廉，同时由于基因重组抗原的应用有利于诊断技术的标准化，以基因重组抗原作为血吸虫病诊断抗原具有良好的研究应用前景。 相似文献
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为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的生物学特性,本实验应用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫MAG1基因,构建真核表达重组质粒pVAX-MAG1,将鉴定正确的pVAX-MAG1重组质粒转染Vero细胞,应用间接荧光检测方法(1FA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫MAG1基因长度为1047bp,与GenBank中登录的MAG1 (EF580924.1)核苷酸序列同源性为99％,IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,western blot分析表达蛋白的分子量为39 ku,具有较好的反应原性.本实验为新孢子虫病核酸疫苗与诊断试剂盒的研究奠定了基础. 相似文献
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应用多个抗原袁位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞袁位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm.将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列.Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
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为提高重组新城疫病毒(NDV)外源基因表达量,本研究采用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV) HLJ07株VP2双拷贝基因的重组NDV(rClone30-VP2-IRES-VP2),同时构建表达单拷贝VP2基因的重组NDV (rClone30-VP2)作为对照.间接免疫荧光试验表明VP2蛋白在感染两种重组病毒的鸡胚成纤维细胞(DF-1)中得到表达.Real-time PCR检测结果表明rCIone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2.生长曲线分析表明,两株重组病毒株与亲本NDV LaSota (Clone30)株在细胞培养中可以同样稳定复制.重组病毒株在鸡胚中多次传代之后仍稳定表达VP2蛋白.本研究通过建立NDV的反向遗传操作系统构建了独立表达IBDV双拷贝VP2基因的重组NDV,并证明双拷贝基因的表达水平优于单拷贝基因,为提高重组NDV外源基因的表达量提供了新的思路. 相似文献
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在分析水貂肠炎病毒VP2基因主要抗原位点分布的基础上,设计了1对特异性引物,克隆一段长为846 bp,编码主要抗原位点的基因片段。将该基因片段定向插入表达载体PET-32a中,转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导实现高效表达。诱导表达比较实验结果表明,在37℃,IPTG浓度为1.0 mM,诱导时间为6 h,诱导表达达到最大效率。重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为50 KD,应用兔抗水貂MEV抗体,经Western-blotting验证该重组蛋白具有MEV的抗原性,可为今后抗MEV单克隆抗体制备及相关免疫学检测方法的建立提供良好的抗原物质。 相似文献
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CIAV VP1 C端基因片段克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
将从组织病料中提取到的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到vp1基因,用DNAStar分析软件分析预测VP1的抗原表位,它们主要位于VP1氨基酸序列的第1～95、134～303、327～435位,分别命名为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区.欲表达C端基因片段,含部分Ⅱ区和完整的Ⅲ区.把vp1基因克隆到表达载体pGEX-6p-1上,用BamHI消化重组表达质粒pGEX-vp1,回收含C端基因的大片段,自连转化大肠杆菌感受态细胞,得到重组质粒pGEX-vp1(C).重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果VP1 C端基因片段在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为49kDa.蛋白纯化后作ELISA检测,可与阳性血清反应.本研究为研制应用重组抗原制备ELISA诊断试剂盒奠定了基础. 相似文献