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提取经植物血凝素（PHA）诱导培养的牦牛外周血淋巴细胞总RNA，采用RT-PCR技术扩增并克隆了牦牛IFN-β基因，经PCR和酶切鉴定及测序分析，再克隆到pGEX-4T-1质粒载体中，构建了原核表达重组载体，经IPTG诱导表达重组蛋白，可表达约41 ku的牦牛IFN-β融合蛋白，主要以包涵体形式存在。序列分析结果表明，牦牛IFN-β基因ORF为498bp，与乳牛IFN-β参考序列的同源性高达98．6％，与猪、马、猫、人IFN-β基因的同源性分别为72．5％、68．9％、66．1％和63．5％，而与狗、鼠、鸡等动物的同源性均不超过25％；分子遗传进化树分析也表明，牦牛与乳牛IFN-β基因的亲缘关系最近，而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远，说明IFN-β基因有种属差异性。 相似文献
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植物血凝素（PHA）诱导培养牦牛外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT—PCR技术扩增牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ基因,分别经PCR、酶切鉴定及测序分析后,再分别构建原核表达重组质粒,用SDS-PAGE和Westernblot分析IPTG诱导表达的重组蛋白。序列分析表明,牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为570bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-A参考序列同源性为94．4％,与黄牛INF-α-B基因（M10953）的同源性最高,为97．0％;牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为588bp,与NCBI上发表的奶牛IFN-α-Ⅱ参考序列同源性为94．2％,与黄牛IFN-δ—1基因（XM-871297）的同源性最高,为96．1％。分子遗传进化树分析表明牦牛IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ与黄牛、奶牛和水牛亲缘关系最近,与猪、马、人的次之,与其它动物都较远,说明这两基因均具有种属差异性。诱导表达重组蛋白分析表明,pGEX4T／IFN-α-A和pGEX4T／IFN-α-Ⅱ在大肠杆菌中得到了正确表达,均可表达约44ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,且具有与抗血清发生反应的生物活性。 相似文献
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鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析 总被引：5，自引：1，他引：5
从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础. 相似文献
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克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因,并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA,将其克隆到pMD18～T载体上,测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列,序列分析表明,克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％,与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因,其ORF为408bp,推导编码135个氨基酸。 相似文献
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为了探究热休克因子结合蛋白1(heat shock factor binding protein 1,HSPB1)基因对脂多糖(LPS)诱导的鸡巨噬细胞(HD11细胞)炎症反应的调控机制，试验以不同浓度的LPS刺激HD11细胞不同时间，构建HD11细胞炎症模型，利用HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1瞬时转染HD11细胞后再用最佳浓度的LPS进行刺激，并以仅转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSPB1的HD11细胞为对照，采用实时荧光定量PCR方法检测转染HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1后对白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和α干扰素(IFN-α)基因表达的影响。结果表明：在LPS浓度为1μg/mL、刺激时间为9 h时炎症因子IL-1β基因相对表达量极显著升高(P<0.01),成功构建出HD11细胞炎症模型；与转染pcDNA3.1质粒相比，转染HSPB1基因过表达质粒pcDNA3.1-HSPB1后能极显著下调IL-6、IL-1β和IFN-α基因的相对表达量(P<0.01);受LPS刺激且仅转染pcDNA3.1... 相似文献
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猪白介素-18基因的克隆及其序列分析 总被引：15，自引：3，他引：15
通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT-PCR技术克隆了猪白介素-18(plL-18)基因。序列分析结果表明，克隆的plL-18基因序列与GenBank上登录的plL-18基因序列完全一致，与其他各物种的IL-18基因间具有较大的种属差异性。该基因在国内的成功克隆为IL-18的进一步研究和开发奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中登录的鸭IL-2基因序列设计并合成了1对特异性引物,以经ConA诱导的广州鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出长度为360bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上。酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定结果表明,获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆。测序结果表明,该成熟蛋白基因由360个核苷酸组成,共编码119个氨基酸。克隆的鸭IL-2基因与GenBank上序列号为AY173028及AF294322的鸭IL-2基因的同源性高达99．4％。将目的基因克隆至真核表达载体pPICZαC上,构建了重组质粒pPICZαC—DuIL-2。酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了鸭IL-2基因。SDS-PAGE分析证实,鸭IL-2基因在毕市酵母（Pichiapastoris）中表达成功,表达的重组蛋白的分子质量约为14．3ku。 相似文献
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海兰鸡IL-18全基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
IL-18是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计一对引物,经植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后,提取其总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行了T-A克隆、测序,获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp,与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
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研究目的是检测荷包猪FUT 1和Mx1基因位点多态性及其与免疫指标的相关关系。采用PCR-RFLP技术分析基因多态性,采用ELISA方法检测免疫指标白介素-4(IL-4)、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、α-干扰素(IFN-α)的表达量。结果表明,荷包猪FUT 1基因和Mx1基因Hin6I点酶切位点上显示多态性,优势基因型分别为GG和AA型,在Mx1基因其他两位点处未发现多态性;荷包猪免疫指标IL-4、sIgA、IFN-α的表达量明显高于大白猪(P<0.05),但抗性基因型与免疫指标间的相关性表现不明显。 相似文献
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北京鸭干扰素-α基因的分子克隆与表达 总被引：7，自引：0，他引：7
采用 PCR法从北京鸭 (Anas platyrhynchosdoestica L innaeus)基因组中克隆了其干扰素 - α基因 (BJ- Du IFN- α)。克隆片段长 4 86 bp,编码 1 6 1个 Du IFN-α成熟肽。与已报道的北京鸭干扰素 -α基因相比 ,BJ- Du IFN-α在 2 85位发生了同义变异。将 BJ-Du IFN-α插入原核表达载体 p QE3 0 ,在 E.Coli JM1 0 9工程菌中表达了重组蛋白。经 SDS- PAGE、Western Blot和抗病毒活性测定 ,表达产物占菌体总蛋白的 2 3 %,为重组鸭干扰素 -α(r Du IFN-α)。 r Du IFN-α抗滤泡性口炎病毒 (VSV)活性高达 7.9× 1 0 5U /mg。 相似文献
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根据GenBank中登录的犬白介素-18（IL-18）基因序列,设计了1对特异性引物。将北极狐外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导,用TRIzol裂解,提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增狐狸IL-18基因,连接pMD18-T载体,转化DH5d感受态细胞,获得阳性重组质粒。核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长590bp,含582bp的开放阅读框,编码193个氨基酸,与已知犬IL-18序列的同源性高达98．7％,氨基酸同源性为96．4％。 相似文献
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海兰鸡白细胞介素-18全基因的克隆与序列分析 总被引：7，自引：1，他引：7
白细胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子，在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列，自行设计一对引物，经植物血凝素（PHA）活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后，提取其总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列，其大小为597bp，与在GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现，中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致，为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank中牛干扰素-α(IFN-α)基因序列(A00145),设计并合成了一对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-α全基因,并克隆、测序。结果表明,梅花鹿IFN-α基因全长570bp,编码189个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸;序列比较分析发现,梅花鹿IFN-α基因序列与GenBank发表的17种IFN-α基因核苷酸序列同源性为29.6%～93.7%,氨基酸序列同源性为18.4%～91.1%;梅花鹿与其他17种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-α基因存在种属特异性,亲缘关系越近,同源性越高。梅花鹿INF-α基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-α基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
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2007年4月中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室应用RT-PCR方法扩增出北极狐IFN-α、IL-6、IL-10及貉IFN-α基因序列,其中狐IFN-α、貉IFN-α基因为世界首次扩增序列,狐IL-6、IL-10基因为国内首次扩增序列. 相似文献
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旨在证明α-倒捻子素可以缓解脂多糖(LPS)诱导的IEC-6细胞的炎症并揭示其机制。笔者在体外培养的IEC-6细胞中构建LPS诱导的炎症模型,并通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量PCR(Q-PCR)、蛋白印迹(Western blot)的方法检测α-倒捻子素对LPS诱导的炎症是否有缓解作用。结果表明,5μmol·L-1的α-倒捻子素预处理可以显著降低LPS诱导的前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在IEC-6细胞中的分泌,以及环氧合酶2(COX-2)、IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA的表达(P<0.05)。通过对炎症相关信号通路NF-κB的探究可见,α-倒捻子素能显著抑制Toll样受体4(TLR4)mRNA和NF-κB相关蛋白磷酸化IκBα(pIκBα)和磷酸化p65(pp65)的激活(P<0.05)。综上所述,α-倒捻子素可以通过TLR4/NF-κB信号通路来抑制LPS诱导的IEC-6细胞的炎症,并且可能是治疗炎症疾病的潜在选择。 相似文献
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鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡胚IFN-y基因转录及cDNA克隆的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从鸡新城疫系Ⅰ系疫苗接种的洛阳土种鸡胚脾提取的RNA中扩增到干扰素-γ(IFN-γ)基因cDNA。结果表明，以1：50或1：100稀释度接种后第48h提取的mRNA扩增效果最佳。序列测定显示，所克隆的洛阳土种鸡IFN-γ基因cDNA与所报道的鸡IFN-γ基因cDNA同源性为99．7％，相应的氨基酸序列同源性为100％，说明鸡IFN-γ基因编码区高度保守。 相似文献
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为探讨辣蓼黄酮正丁醇部分(FNB)对内毒素血症小鼠炎性细胞因子的影响,采用酶解-超声偶联法提取辣蓼全草中的总黄酮,结合大孔树脂纯化富集获得辣蓼正丁醇部分黄酮,通过不同剂量的FNB作用于脂多糖(LPS)刺激所诱导的小鼠内毒素血症模型,测定丙二醛(MDA)、MPO、T-AOC、T-SOD、GSHPX、GSH、LZM、ACP及炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素(IFN,IFN-α、IFN-γ)、白介素-2(IL-2)水平。结果表明,FNB能通过提升小鼠肝脏的抗氧化防御酶促体系的活性,减少LPS刺激所诱导的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的释放,降低肺部TNF-α、IFN-α、IFN-γ以及IL-2mRNA的表达水平。说明一定浓度的FNB能减轻LPS诱导的内毒素血症对小鼠的损伤,改善生存率。 相似文献
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堆型艾美球虫广东株3—1E基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：2
根据GenBank中登录的堆型艾美球虫3—1E基因序列，设计了3条引物，以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了3—1E基因部分片段，将这一片段克隆至pGEM—TEasy载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现，所克隆的基因片段与Eimeria acervulina美国株(US)、E.acervulina QH株3—1E cDNA的核苷酸同源性分别为99．0％和99．2％，推导氨基酸的同源性分别为98．2％和97．6％。 相似文献