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目的表达小反刍兽疫F蛋白的抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫的抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中PPRV的F基因的抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经ITPG诱导表达PPRVF基因的抗原位点;用SDS-PAGE和Western-Blotting分析抗原位点蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-F35-111(pZLW013)、PET-28b-F143-485(pZLW014)和PET-28b-F323-485(pZLW015)酶切后,均出现与预期相符的片段;DNA测序表明插入的片段的序列与小反刍兽疫F基因的抗原位点序列分别完全一致,其大小分别为251bp、1053bp和514bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和West-ern-Blotting分析,证明小反刍兽疫抗原位点F35-111没有表达、抗原位点F143-485和F323-485得到表达。结论成功表达了PPRVF基因的两段抗原位点蛋白,为日后检测与预防工作奠定了基础。 相似文献
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参照GenBank中小反刍兽疫病毒（PPRV）H抗原基因序列，人工合成了PPRVH基因，将其克隆至PUC18-T质粒中，转化E．coli JM109感受态细胞，构建并选择PPRVH基因克隆重组质粒，经核苷酸序列分析正确，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化E．coli TOP10感受态细胞，核苷酸序列分析证实，成功构建了PPRVH基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导，可稳定、高效地表达PPRVH抗原。SDS-PAGE分析结果表明，用终浓度为0．2g／L的L-阿拉伯糖诱导5h的表达量最高，表达蛋白为分子质量约83ku的融合蛋白；经薄层扫描分析，其表达产量约占菌体总蛋白的10％。Western-blotting检测表明，诱导的蛋白能与PPRVH蛋白单抗发生特异性反应，说明表达的融合蛋白中含有PPRVH糖蛋白抗原。 相似文献
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目的将小反刍兽疫病毒M蛋白基因截短表达后用于特异性单抗制备及临床抗体水平检测。方法:用在线分析软件BepiPred分析小反刍兽疫病毒M蛋白潜在的B细胞线性表位,以本实验室构建的pCR2.1T-PPRV M质粒为模板,扩增三段截短的M基因,纯化后的PCR产物分别与克隆载体pCR2.1T连接,筛选出的阳性重组质粒经双酶切后,分别与表达载体pET-32a(+)及pGEX-6p-1连接,再将鉴定为阳性的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)菌株诱导表达,并用SDS-PAGE及Western blot验证。结果 PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段。对连接克隆载体及表达载体的重组质粒双酶切后,均出现与预期一致的片段,DNA测序表明,插入片段序列与小反刍兽疫Nigeria75/1株M蛋白基因完全一致。重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明所构建的重组蛋白均获得高效表达,并均具有良好的反应原性。结论成功表达了小反刍兽疫截短M基因的蛋白,为制备特异性单抗及小反刍兽疫抗体检测奠定了一定基础。 相似文献
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小反刍兽疫病毒N、H和F蛋白的真核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
目的构建小反刍兽疫病毒(PPRV)H、N、F、NF重组真核表达质粒并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的N、H、F基因序列并克隆到真核表达载体pIRES1neo中,最后用PCR、酶切和序列分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒以磷酸钙介导法转染Vero细胞,用免疫荧光方法鉴定其在细胞中的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;重组质粒经pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫病毒N、H、F蛋白基因序列完全一致,其大小分别为1575bp、1830bp和1641bp;将重组质粒感染真核细胞,经免疫荧光检测,证明所有蛋白均得到表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF,为继续进行基因免疫研究奠定了基础。 相似文献
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将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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《中国兽医杂志》2014,(10)
应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,并对其抗原性进行鉴定。扩增小反刍兽疫病毒Tibet 07株H基因,克隆至p Fast Bac/CT-TOPO载体中,构建重组穿梭质粒p Fast Bac-PPRV-H,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,通过病毒蚀斑试验检测扩增后病毒滴度。将P3代病毒以0.05MOI感染sf9细胞,通过SDS-PAGE鉴定H蛋白的表达,利用Western blot和间接免疫荧光鉴定H蛋白的抗原性。经过PCR、测序等证明重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H构建正确。P2代重组杆状病毒的病毒滴度为1×107。表达的H蛋白在相对分子量约68 k Da处可见特异蛋白条带。感染的sf9细胞可与小反刍兽疫病毒H蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。表明Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,为进一步研究其生物学功能及构建检测ELISA试剂盒奠定了试验基础。 相似文献
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《经济动物学报》2015,(3)
采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。 相似文献
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新疆绵羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP2b的克隆与表达 总被引：2，自引：0，他引：2
表达新疆绵羊布鲁氏菌外膜抗原蛋白OMP3b的表达蛋白OMP2b，探索其作为诊断抗原和亚单位疫苗的可能性。采用PCR方法，从新疆绵羊布鲁氏菌基因组DNA中扩增出omp2b基因片段，将该片段克隆于原核表达载体PET-28a（＋），构建成重组质粒，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测。结果表明，获得长约1083bp的PCR片段，序列分析结果与已知绵羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP2b同源性达89.72％；SDS-PAGE检测表达产物，在相对分子质量39ku处有表达带。获得了新疆绵羊布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白omp2b基因片段，并在大肠杆菌中实现了表达。 相似文献
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狂犬病病毒糖蛋白基因中和抗原表位在大肠杆菌中的串联表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法从狂犬病病毒HEP株中克隆狂犬病糖蛋白膜外区全长基因。利用突变PCR方法,将糖蛋白基因中三段中和抗原位点串联,克隆至pET-28a表达载体。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达并确定最佳诱导条件。SDS-PAGE电泳结果显示所表达的蛋白大小与预期相符。经Western-blotting检测,串联表达的狂犬病糖蛋白基因中和抗原位点可与狂犬病标准阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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从小反刍兽疫病毒全长cDNA中对血凝素蛋白H基因进行特异扩增,回收PCR产物分别连接于T载体酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBacHT,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒。重组质粒转染sf9细胞后连续传3～4代,分别收获细胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western blot对重组H蛋白的检测,用抗His蛋白单抗在细胞中检测到H标签蛋白,单抗在细胞及上清中检测到大小为46 ku的融合蛋白。 相似文献
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Chunsheng Yin Weiye Chen Qianqian Hu Zhiyuan Wen Xijun Wang Jinying Ge Qianqian Yin Haibing Zhi Chun Xia Zhigao Bu 《Veterinary research》2014,45(1):62
Peste des petits ruminants (PPR) and foot-and-mouth disease (FMD) are both highly contagious diseases of small domestic and wild ruminants caused by the PPR virus (PPRV) and the FMD virus (FMDV). In this study, a recombinant PPRV expressing the FMDV VP1 gene (rPPRV/VP1) was generated and FMDV VP1 expression did not impair replication of the recombinant virus in vitro and immunogenicity in inducing neutralizing antibody against PPR in goats. Vaccination with one dose of rPPRV/VP1 induced FMDV neutralizing antibody in goats and protected them from challenge with virulent FMDV. Our results suggest that the recombinant PPRV expressing the FMDV VP1 protein is a potential dual live vectored vaccine against PPRV and FMDV. 相似文献