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1.
《中国畜牧兽医》2020,(6)
为获得高纯度的鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白自组装的亚病毒颗粒(subviral particles,SVPs),并对重组VP2蛋白(rVP2)SVPs的组装效率和均一性进行评价,本试验利用大肠杆菌表达IBDV rVP2,通过SDS-PAGE和Western blotting对蛋白表达情况和免疫反应性进行鉴定,通过阴离子交换层析和切向流超滤浓缩系统纯化rVP2蛋白,并通过透射电镜(TEM)、高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)、蔗糖密度梯度离心及粒径和表面电位(Zeta potential)等多种检测技术对单个SVP组装形态和整体组装情况进行分析检测,初步建立了IBDV rVP2 SVPs组装效率的系统性检测方法。结果显示,在大肠杆菌中实现IBDV rVP2的大部分可溶性表达,且能与鸡IBDV阳性血清有明显的免疫反应性,纯化后rVP2纯度提高66.9倍,回收率达到93.3%。TEM观察rVP2自组装成直径约25 nm的SVPs,视野内SVPs大小均一,均匀分散。HPSEC检测结果显示,rVP2 SVPs的分子质量约为2 482 ku,与20个VP2三聚体形成的T=1二十面体SVPs分子质量一致。蔗糖密度梯度离心检测结果显示,rVP2 SVPs体积分布均一,组装效率高。粒径和Zeta电位检测结果表明,rVP2 SVPs颗粒分散度较好、体系稳定,有利于rVP2 SVPs的长期保存。本试验通过多种检测技术对rVP2 SVPs的组装情况进行检测分析,实现了rVP2 SVPs的高效组装,为IBDV SVPs疫苗的质量控制提供了有力支撑。 相似文献
2.
猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
为获得较高纯度的猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2） Cap蛋白的病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap （PCV2 rCap）蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜（TEM）观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱（HPSEC）检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35~19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。 相似文献
3.
不同传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2表达差异性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
将在不同时间、地域从传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中获得的15个IBDV株分别用SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增殖，经氯仿处理后，采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不边疆蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒，检测表明，病毒主要分布于40%蔗糖层，对纯化病毒进行SDS-PAGE分析，结果显示，病毒结构蛋白VP2在不同毒株表达量有较大差异。本实验为IB-DV主要保护性抗原VP2高表达疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
4.
试验旨在制备水貂肠炎病毒（Mink enteritis parvovirus,MEV）可溶性VP2蛋白及其病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。优化并合成MEV VP2基因,克隆至原核表达载体pET-30a（+）,将重组质粒pET-30a-VP2与分子伴侣pTf16共同转化到宿主菌ER2566中,以不同培养温度、L-阿拉伯糖浓度和IPTG浓度进行诱导表达,收集样品进行SDS-PAGE和Western blotting分析。通过硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法对表达产物进行纯化,由SDS-PAGE进行鉴定,透析去除蔗糖,通过动态光散射技术（DLS）和透射电子显微镜（TEM）观察不同组装条件下VLPs的粒径和形态。用制备的MEV VLPs疫苗免疫水貂评价其免疫原性。结果显示,以2 g/L L-阿拉伯糖、0.2 mmol/L IPTG、25 ℃培养16 h为诱导条件时,VP2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量约为65 ku。经Western blotting鉴定VP2蛋白具有良好的抗原特异性。将此表达产物利用硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法纯化后,纯度可达90%以上。在pH 8.0,150 mmol/L NaCl的透析液中,VP2经自组装可形成与天然MEV形状和粒径相似且具有血凝特性（1：214）的VLPs。VLPs疫苗免疫水貂21 d后,测得水貂血清中的血凝抑制（HI）抗体水平均相对最高,可达1：211,说明该VLP疫苗有较好的免疫原性,能有效预防MEV的感染。本试验结果表明,将pET-30a-VP2与pTf16在原核表达系统中共表达,可获得具有高免疫原性的VLPs,为后期MEV VLPs疫苗的研发奠定基础。 相似文献
5.
将在不同时间、地域从传染性法氏囊病 (IBD)发病鸡群中获得的 15个IBDV株分别用SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增殖 ,经氯仿处理后 ,采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒 ,检测表明 ,病毒主要分布于 40 %蔗糖层。对纯化病毒进行SDS_PAGE分析 ,结果显示 ,病毒结构蛋白VP2 在不同毒株表达量有较大差异。本实验为IB DV主要保护性抗原VP2 高表达疫苗的研究奠定了基础 相似文献
6.
试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。 相似文献
7.
为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。 相似文献
8.
为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35～19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。 相似文献
9.
传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
传染性法氏囊病病毒（IBDV）能引起以淋巴细胞衰竭为特征的抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原，在VP2上的点突变是造成IBDV抗原漂变的主要原因。为研究VP2作为IBDV亚单位疫苗的潜力，本实验将IBDV JD1株的VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，将重组载体pBacPAK-VP2与病毒Bm-Bac-PAK6的线性化DNA共转染家蚕培养细胞，获得重组病毒BacPAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有VP2基因。重组病毒感染家蚕5龄幼虫后，用ELISA、SDS－PAGE和Western blotting检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性，感染后5－6d在蚕血淋巴中的表达量最高。 相似文献
10.
传染性法氏囊病（infectious bursal disease virus,IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一种主要危害雏鸡的急性传染病。在IBDV编码的5个蛋白中,VP5是IBDV唯一可以缺失基因的蛋白。本研究克隆了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白编码基因,利用原核表达系统表达了VP5蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备VP5多抗,并对多抗进行了鉴定和检测不同IBDV毒株的应用。结果显示,IBDV优势流行毒株的VP5蛋白实现了可溶性表达,分子质量约为17 kDa;制备的VP5多抗特异性良好,ELISA效价可达1:64 000;VP5多抗可通过IFA和Western Blot检测识别IBDV rHLJ0504-HT株,不识别VP5基因缺失株。结果表明：试验成功表达了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白,并制备了VP5多抗;VP5多抗可对IBDV及其VP5编码基因缺失毒株进行鉴别检测。本研究对于IBDV检测方法的建立以及VP5编码基因功能的进一步研究提供了物质基础。 相似文献
11.
【目的】实现A型塞内卡病毒（Seneca virus A,SVA）VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列（登录号：KY747514.1）,基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度（MFI）,从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16 ℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Western blotting分析,可在82 ku处出现明显条带。将VP1 蛋白与荧光微球偶联,阴性对照（背景）的平均荧光值为17（＜100）。测试孔的平均MFI为2 339.5（＞2 000）,证明SVA VP1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中SVA抗体的检测。【结论】本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了SVA VP1蛋白,初步建立了SVA抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础。 相似文献
12.
为探究撒坝猪源大肠杆菌（E.coli）高致病性毒力岛（HPI）诱导小鼠病理损伤的超微结构特征,本研究将实验室保存的E.coli HPI阳性株（HPI+）和E.coli HPI基因缺失株（ΔHPI）进行复苏和培养,分别用E.coli HPI+、E.coli ΔHPI菌株以腹腔接种的方式感染昆明小鼠,检测菌株的半数致死量（50% lethal dose,LD50）,通过HE染色和透射电镜观察并分析菌株对小鼠病理损伤的超微结构特征,利用免疫组织化学标记白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）阳性细胞在被感染小鼠肝脏和肾脏组织中的分布,以反映E.coli HPI+及E.coli ΔHPI菌株所引起炎症水平的差异。结果显示,E.coli HPI+和E.coli ΔHPI菌株的半数致死量分别为1×107.39和1×108.62 CFU/mL;HE染色显示,E.coli感染小鼠后,可见肝脏细胞肿胀、变性,肝窦淤血,肾脏间质淤血,肾小管上皮细胞变性脱落等病理变化;超微结构变化显示,肝脏细胞的完整形态消失,胞核呈不规则形态,线粒体畸形,粗面内质网上核糖体脱落,滑面内质网增生;多数肾小管上皮细胞出现胞核固缩,部分细胞核核仁边移、体积增大,足突融合,系膜细胞间隙变宽。此外,E.coli HPI+感染组小鼠于肝脏、肾脏的水肿现象较E.coli ΔHPI菌株感染的小鼠更为明显。免疫组化结果显示,大肠杆菌感染小鼠后,IL-1β蛋白主要表达于肝细胞、中央静脉周围、肾间质细胞和肾小管上皮细胞,且E.coli HPI+感染组的IL-1β表达量高于E.coliΔHPI感染组。综上所述,撒坝猪源E.coli HPI能够调控E.coli对小鼠的致病性,HPI的调控作用可使E.coli对小鼠肝脏、肾脏造成的病变及超微结构变化更明显,并且能够增加小鼠的炎症反应。 相似文献
13.
【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV） VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒（Human adenovirus serotype-5，HAdV-5），以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2；PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞，利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2；将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞，包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5（rAd5-VP2），将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞（Vero、CEF和DF1细胞）并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养，测得第10代病毒的滴度为7.9×109 IFU/mL；RT-PCR结果显示，VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译；Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达，蛋白分子质量为41 ku；将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达，表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5，该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。 相似文献
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【目的】 利用原核表达系统表达P[1]型A群牛轮状病毒(BRVA) VP8重组蛋白,并评价其反应原性与免疫原性。【方法】 根据国内流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1] VP8基因序列(GenBank登录号:MN937517)进行密码子偏好性优化,构建P[1]型BRVA VP8大肠杆菌原核表达系统,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,Western blotting鉴定重组蛋白与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合能力,并将P[1]型BRVA VP8重组蛋白免疫兔,首免后2周加强免疫1次,共免疫2次。分别用间接ELISA方法与中和试验评价其免疫原性。【结果】 本研究成功构建P[1]型BRVA VP8重组蛋白的原核表达系统;SDS-PAGE结果显示,高效表达大小为20 ku的P[1]型BRVA VP8重组蛋白,以可溶形式存在;Western blotting结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白能与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合;间接ELISA结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白亚单位疫苗能诱导兔产生抗体,兔首免1周后抗体开始出现并迅速上升,于第3周达到高峰,至第5周仍维持在较高水平;中和试验结果显示,第2次免疫后抗体最高的兔血清对G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效价分别为1∶17 783和1∶64。【结论】 本研究成功构建原核表达系统表达P[1]型BRVA VP8重组蛋白,并证实其具有良好的反应原性及免疫原性,为研制BRVA亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
15.
本研究旨在探讨猪m6A甲基化酶WTAP表达水平与大肠杆菌（E. coli）感染抗性的关系。选取35日龄苏太断奶仔猪（Sus scrofa）大肠杆菌抗性型和敏感型个体各4头,采集十二指肠和空肠组织,利用RT-qPCR检测WTAP在E. coli抗性型和敏感型个体十二指肠、空肠的表达差异,并分别利用产肠毒素大肠杆菌（F18ab、F18ac）刺激和内毒素（LPS）诱导猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,检测WTAP基因的表达变化。同时构建WTAP基因干扰载体并转染IPEC-J2细胞,通过菌毛定量、菌落计数以及间接免疫荧光试验检测该基因沉默对大肠杆菌黏附能力的影响。结果显示：在十二指肠和空肠组织中,WTAP基因在E. coli抗性型个体中的表达量显著高于敏感型个体（P<0.01）;并且在F18ab和F18ac刺激后表达量显著下降,与LPS诱导6 h后结果相一致（P<0.01）。沉默WTAP基因后,大肠杆菌黏附能力极显著上升（P<0.01）。本研究在细胞和个体水平上验证发现,m6A甲基转移酶WTAP的高表达可能有助于仔猪抗大肠杆菌感染,为进一步揭示仔猪抗大肠杆菌感染的RNA甲基化调控机制奠定基础。 相似文献
16.
SN Pradhan PR Prince J Madhumathi P Roy RB Narayanan U Antony 《Veterinary immunology and immunopathology》2012,148(3-4):293-301
Infectious bursal disease virus (IBDV) is the causative agent of Gumboro disease and poses a huge threat to poultry industry. The risks associated with conventional attenuated viral vaccines make it indispensable to probe into the development of novel and rationally designed subunit vaccines which are safer as well as effective. VP2 is the major host-protective antigen found in IBDV capsid. It encompasses different independent epitopes responsible for the induction of neutralizing antibody. Here, we report the efficacy of the immunodominant fragment of VP2 which induces both humoral and cellular immunity against infectious bursal disease. A 366bp fragment (52-417bp) of the VP2 gene from an IBDV field isolate was amplified and expressed in Escherichia coli as a 21kDa recombinant protein. The efficacy of rVP2(52-417) antigen was compared with two commercial IBDV whole virus vaccine strains. The rVP2(52-417) induced significantly high antibody titres in chicken compared to commercial vaccines and the anti-rVP2(52-417) sera showed reactivity with viral antigens from both commercial strains (P<0.0001) and field isolates. Also, the chicken splenocytes from rVP2(52-417) immunized group showed a significantly high proliferation (P<0.01) compared to other groups, which implies that the rVP2(52-417) fragment contains immunogenic epitopes capable of eliciting both B and T cell responses. Further, rVP2(52-417) conferred 100% protection against vIBDV challenge in the immunized chickens which was significantly higher (P<0.001) compared to 55-60% protection by commercial vaccine strains. Hence, the study confirms the efficacy of the immunodominant VP2 fragment that could be used as a potent vaccine against IBDV infection in chicken. 相似文献
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为探索调控家鹅繁殖性能的技术,本研究通过设计合成鹅促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）序列片段,酶切后连接到诺如病毒（Nov）P基因重组pEGX-4T-1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取阳性菌重组质粒,并通过测序和酶切进行验证。将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western blotting检测重组蛋白表达。进一步在不同IPTG浓度及诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件,在最佳条件下的诱导菌液经过离心收集菌体,并超声波破碎离心后对重组蛋白可溶性进行分析。利用xTractor Buffer和Glutathione Superflow树脂对重组蛋白进行纯化,并使用自制的抗GnIH鹅血清及抗鹅二抗通过Western blotting检测重组蛋白。结果显示,重组质粒Nov P-partical-GnIH经双酶切鉴定获得大小约为96 bp的目的基因条带,进一步测序结果证明重组质粒构建成功。诱导表达的重组蛋白分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导2 h条件下表达量最高;菌体超声破碎后经SDS-PAGE检测,重组蛋白主要表达在沉淀中。重组蛋白与GST单抗及抗GnIH阳性血清均能反应,表明此重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。本研究通过对Nov P-partical-GnIH蛋白原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的重组蛋白,将有助于进一步建立家鹅的繁殖性能免疫调控方法,为提高繁殖性能及调控繁殖机制的研究奠定基础。 相似文献
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本研究旨在克隆犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列（登录号：KY063618.2）,选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30 ℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。 相似文献
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本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。 相似文献