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为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1∶4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54ng/mL,持续时间为15d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。 相似文献
3.
为建立检测感染猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)或PRRSV弱毒疫苗免疫后猪群体内抗体水平的方法,本研究以PRRSV GP5基因的原核表达蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法。利用RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,将其克隆于p GEX-6p-1中构建原核重组表达载体p GEX-6P-GP5,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,以梯度尿素法对表达蛋白纯化后,以其为包被抗原,利用方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了GP5蛋白的最佳包被浓度是150 ng/孔,被检血清的最佳稀释倍数为80倍。试验结果显示,该检测方法的特异性、敏感性、重复性很强。从山东各地采集203份猪血清样品进行检测,结果显示该检测方法与商品化PRRSV抗体检测试剂盒(法国LSI)检测结果的符合率为96.5%。本研究建立的间接ELISA方法,为猪群体内PRRSV抗体水平的检测提供了重要的检测手段,在疫苗免疫效果的评价方面有着广泛的应用。 相似文献
4.
克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。 相似文献
5.
为分析猪乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白Ⅲ结构域的抗原性,本研究克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的E蛋白结构域Ⅲ,并通过pET-28a载体进行融合表达和纯化。用纯化后蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,通过SDS-PAGE、Western blotting、间接ELISA及间接免疫荧光方法(IFA)检测小鼠及猪抗体滴度,验证E蛋白结构域Ⅲ的抗原性。SDS-PAGE结果表明融合蛋白以包涵体形式表达;Western blotting、间接ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性;纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠ELISA方法检测特异性抗体滴度可达1×105;猪JEV阳性血清ELISA抗体滴度可达5.1×104;IFA结果表明JEV E Ⅲ蛋白产生的抗血清能很好的识别乙型脑炎病毒抗原。以上结果表明,表达、纯化的重组JEV E Ⅲ蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为建立以E蛋白结构域为抗原的诊断方法提供了重要依据。 相似文献
6.
为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。 相似文献
7.
试验旨在研究猪腺病毒3型(PADV3)Protease蛋白在大肠杆菌中的表达,并制备该蛋白的多克隆抗体。利用PCR扩增PADV3 Protease基因,构建重组原核表达载体pET28a-PADV3-Protease和真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease,采用双酶切和测序鉴定;将原核表达载体pET28a-PADV3-Protease转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组原核表达菌株,经IPTG诱导收集蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定,将目的蛋白纯化后与佐剂乳化制备免疫原免疫家兔,制备Protease蛋白多克隆抗体;将真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease转染HEK293细胞经G418筛选建立稳定表达EGFP-Protease融合蛋白的细胞系,以该稳定表达细胞系为包被抗原,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性与抗体滴度。结果显示,Protease基因开放阅读框(ORF)为615 bp,原核表达系统中Protease蛋白以包涵体形式存在,分子质量大小为23 ku,与真核细胞表达的Protease蛋白分子质量一致,该蛋白在细胞核与细胞质中均有分布,制备的Protease蛋白多克隆抗体能与EGFP-Protease融合蛋白稳定表达真核细胞系发生特异性的反应,与对照细胞无反应。本试验构建了Protease蛋白原核表达菌株和真核表达细胞株,制备的PADV3-Protease蛋白多克隆抗体免疫活性良好,为进一步研究Protease蛋白的生物学功能和PADV3的血清学诊断提供了基础材料。 相似文献
8.
为了建立快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的方法,试验采用RT-PCR扩增ORF5基因,克隆至原核表达载体pET-28a上,诱导重组质粒转化菌表达,SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况,Western-blot检测表达蛋白免疫活性,亲和层析纯化表达蛋白。用SPA标记胶体金,分别以纯化E融合蛋白和羊抗猪抗体为检测线和质控线制备胶体金试纸,用所研制的试纸检测猪血清样品40份,并与IDEXX ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果表明:成功表达E融合蛋白,表达蛋白具有良好的反应原性,纯度为90%;制备的胶体金试纸与IDEXX ELISA试剂盒检测符合率为92%。说明该种方法可检测PRRSV抗体。 相似文献
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为了研究Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)抗体依赖性增强作用(ADE)感染中的作用,对2种结构域蛋白进行表达、纯化,并免疫大白兔制备其特异性多克隆抗体IgG。应用制备的抗Sn-N-V-set IgG、CD163-SRCR5 IgG和正常兔IgG分别封闭PAMs细胞,然后使用猪抗PRRSV IgG与PRRSV悬液混合后制成的感染性免疫复合物感染已封闭的PAMs细胞。感染后每隔12 h收集细胞上清液1次,用已建立的实时荧光定量RT-PCR方法测定PRRSV的RNA拷贝数,同时以Marc-145细胞测定PRRSV的病毒滴度。结果显示,当Sn受体N端V-set结构域和CD163受体SRCR5结构域被其特异性抗体封闭后,能够显著抑制体外PRRSV感染PAMs细胞的抗体依赖性增强作用(ADE)(P<0.01)。结果表明,2种受体结构域均参与PRRSV-ADE感染。 相似文献
10.
为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。 相似文献