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1.
狂犬病病毒糖蛋白胞外区基因的原核表达、纯化及鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。 相似文献
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分析棉花盐胁迫相关的EST文库,设计特异性引物,利用RACE技术从棉花中克隆出苹果酸脱氢酶（ Malate dehydrogenase ,MDH）基因,命名为GhMDH。基因全长1130 bp,最大开放阅读框1014 bp,编码338个氨基酸,分子量为35．495 kDa,等电点pI＝8．94。将该基因编码区插入到原核表达载体pET23b中,获得pET23b-GhMDH重组载体。利用IPTG诱导表达目标蛋白,发现通常条件下获得的重组蛋白以包涵体的形式存在。对诱导时间、IPTG浓度和温度等条件进行优化,结果表明,除了在28℃低温以下诱导的蛋白有少量为可溶,其他条件诱导的蛋白均以包涵体形式存在。为了得到足够的重组蛋白,对GhMDH包涵体蛋白采用脲素缓冲液溶解,对提取液进行镍亲和层析柱纯化,对洗脱的产物经脲素梯度透析复性。利用生化测定法测定目标蛋白的酶活性,结果表明,克隆的GhMDH基因编码蛋白酶具有脱氢酶活性。以上结果为GhMDH在棉花体内氧化还原动态以及参与抗逆功能等研究提供前提条件。 相似文献
3.
芽孢杆菌蛋白酶基因apr的克隆、 表达及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【研究目的】克隆从新疆吐鲁番地区土样分离获得产蛋白酶菌株Bacillus tequilensis C9蛋白酶基因apr,建立蛋白酶基因异源表达体系。【方法】采用PCR技术克隆获得目的基因,利用生物信息学软件进行序列分析,构建pET-28a原核表达重组质粒,转化BL21大肠杆菌,37℃下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活。【结果】蛋白酶基因apr全长1098 bp,与Bacillus subtilis aprE (AB734697)有98%的同源性,编码含有299个氨基酸残基的成熟蛋白,是易溶、亲水性较强的蛋白,属于Peptidases_S8_S53 superfamily蛋白家族,融合蛋白分子量为29 kDa,蛋白酶酶活为28.4 u/mL。【结论】试验为构建蛋白酶基因高效表达体系奠定理论基础。 相似文献
4.
樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。 相似文献
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通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。 相似文献
6.
分析大豆GmNF-YA3基因结构,构建GmNF-YA3基因的原核表达载体并进行表达,以期获得带有GST标签的目的蛋白口通过Phytozome数据库对。nNF-YA3基因组DNA序列进行生物信息学分析,序列比对结果表明GmNF-YA3基因组DNA序列长度为4589bp,由5个外显子和4个内含子组成。为了获得纯化的GmNF-YA3蛋白,将保守域片段亚克隆到原核表达载体pGEX4T-1中,SDS-PAGE表明融合蛋白受异丙基硫代半乳糖普(IPTG)诱导高水平表达,但主要以包涵体形式存在。本研究为进一步纯化和鉴定GmNF-YA3蛋白及研究其功能奠定了基础。 相似文献
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李矮缩病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备李矮缩病毒(Prunus dwarf virus, PDV)抗血清,克隆PDV外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。以阳性感病甜樱桃叶片为试验材料,提取总RNA,根据PDV CP基因(L28145.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-PDVCP,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达。PDV CP基因（Genbank登录号：JF333587.1）全长657 bp,编码217个氨基酸,与GenBank其他PDV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.2%~93.9%,推导的氨基酸序列同源性为97%~99%。根据完整CP基因核苷酸序列构建系统进化树显示：12个PDV分离物可分为3组,泰安分离物与巴西、土耳其等分离物属于Ⅰ组。成功构建原核表达载体pET30a-PDVCP,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。转pET30a-PDVCP载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在30℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导4 h表达量最大。 相似文献
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羽衣甘蓝泛素结合酶ubc7基因分离、原核表达及纯化 总被引：1，自引：1，他引：0
为分离羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)泛素结合酶7(ubc7)基因,探讨Ubc7重组蛋白的原核表达及纯化。利用CTAB的方法提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR的方法分离ubc7基因,将编码ubc7基因的cDNA序列亚克隆到pET-14b原核表达载体中,将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达,并通过Ni2+-NTA树脂进行亲和层析的方法纯化重组蛋白。结果表明,获得的Boubc7含有一个长度为501 bp的开放读码框,编码一个含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测BoUbc7的相对分子质量约为18.7 kDa,理论等电点(pI)为5.35。利用IPTG诱导的细菌蛋白中,SDS-PAGE显示出在分子量大小23 kDa处有蛋白特异性的表达,这与预测的His6融合的BoUbc7蛋白分子量相符;利用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析纯化后,成功获得了BoUbc7融合蛋白。该试验分离了羽衣甘蓝ubc7基因,并通过原核表达系统获得了BoUbc7重组蛋白,为进一步分析其生物学功能奠定了基础。 相似文献
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克隆油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1,实现该基因在原核系统中重组表达,为研究其功能奠定基础。采用TRIzol法提取总RNA,通过RT-PCR法扩增BnLIP1编码序列,构建原核表达载体pEL1并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后通过SDS-PAGE检测目的蛋白。根据GenBank报道的序列设计引物,从萌发的油菜种子黄化幼苗中成功克隆到BnLIP1的编码序列,长度为1170bp。将该编码序列构建到原核表达载体pET32a( )并与标签序列融合,在E.coliBL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的BnLIP1蛋白,大小约为61kDa。首次实现了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系统中的表达,为GDSL脂肪酶Bn-LIP1蛋白的分离纯化及活性研究奠定了基础。 相似文献
10.
GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。通过对Genbank进行Blast比较,我们首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DELLA蛋白一样的保守结构域,我们对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21（DE3）菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白, 大小约为64kDa。首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达, 为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础。 相似文献
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为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b 基因271 bp和LMoV cp 基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMoV病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到cDNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体pFGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMoV的RNAi植物表达载体pFGC5941-C2和pFGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。 相似文献
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为阐明贪铜菌6-5的耐镉机理,更有效的治理土壤重金属污染。本研究利用同源序列克隆技术从本研究室筛选的高耐镉菌株贪铜菌6-5中成功克隆出双组分信号转导系统
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为了探明MADS-box基因在山葡萄性别分化中的作用,笔者利用实时荧光定量PCR技术对Vv MADS5和Vv MADS8 2个基因在山葡萄雌、雄花发育过程的表达情况进行分析。结果表明,2个基因在山葡萄雌花和雄花中都有表达,Vv MADS8在雌花和雄花中的表达趋势以及表达量基本相同。Vv MADS5在雌花和雄花中的表达类型相同,而其在雌花中的表达量显著高于雄花。Vv MADS8在花芽膨大期(4月30日)表达量最高,而Vv MADS5在花序展露期(5月14日)表达量最高。Vv MADS8、Vv MADS5参与山葡萄性别分化,但不是控制性别分化的关键基因。 相似文献
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利用改良蝉蜕诱导培养基对球孢白僵菌进行诱导,以无蝉蜕PDA培养基作为对照,目的是比较蝉蜕诱导后球孢白僵菌菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率等多个生物学指标,及二者对3龄亚洲玉米螟幼虫的毒力。经蝉蜕诱导的球孢白僵菌菌株的产孢量、孢子萌发率以及对玉米螟幼虫毒力都高于对照组,且差异显著,对玉米螟幼虫毒力处理组LT50为4.73天,对照组需要6.97天。同时经蝉蜕诱导过的菌株开始产孢时间和胞外蛋白酶活性都优于对照组,胞外蛋白酶活性的变化范围是1.497×10-2~3.538×10-2 IU/mL,但经诱导菌株的生长速率低于处理组。鉴于球孢白僵菌菌株经蝉蜕诱导后,其产孢量和孢子萌发率增加,并且能够增强对玉米螟幼虫毒力,可利用其进行球孢白僵菌菌种保存和改良。
相似文献15.
中介蝮蛇毒纤溶酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为了从中介蝮蛇毒腺中提取总RNA,研究其具有重要药用价值的纤溶酶,从基因工程的角度进行研究开发蛇毒资源。通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到FLE基因,再亚克隆到pPROEXHTb原核表达载体上,构建重组表达载体;将阳性重组表达载体转化到大肠杆菌中诱导表达,采用SDS-PAGE检测该重组蛋白的分子量。结果表明：成功的构建了重组原核表达载体ppPROEXHTb-FLE,并在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白分子量约为30 KDa。说明可以采用该方法进行中介蝮蛇毒纤溶酶的原核表达,该研究为进行蛇毒纤溶酶的开发奠定了分子基础。 相似文献
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为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。 相似文献
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沉水植物苦草和轮叶黑藻对水环境的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
为了研究沉水植物苦草和轮叶黑藻的对水环境的影响,在控制条件下单独种植苦草、轮叶黑藻和二者混种,笔者比较研究了苦草、苦草+黑藻、黑藻组合水体中总氮(TN)、总磷(TP)、铵氮(NH4+-N)、叶绿素a、总悬浮质(TSS)及总有机氮(TOC)浓度的区别。结果表明:苦草和轮叶黑藻对水环境的影响不同,单独种植苦草时,上覆水中总氮和氨氮含量高于其他处理,但总磷、叶绿素、TSS和TOC含量都低于轮叶黑藻单种和混种处理。研究结果说明,苦草对于降低上覆水中总磷和叶绿素含量作用优于轮叶黑藻,对维持水体水质有良好效果。 相似文献
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为进一步明确引起马铃薯晚疫病的致病因子,通过克隆马铃薯晚疫病致病疫霉菌分泌蛋白中的半胱氨酸蛋白酶家族基因,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达。本试验采用TA克隆法,提取来自云南马铃薯产区的致病疫霉菌XH05-5-4的总RNA,反转录cDNA,PCR扩增后将该基因片段连接到载体,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。克隆获得半胱氨酸蛋白酶家族基因全长为1176 bp,包含1个最大的开放阅读框1077 bp,编码387个氨基酸。推测蛋白相对分子量41.671 kD,理论等电点4.88;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的蛋白与预期蛋白相符合。生物活性测定表明：马铃薯叶片出现坏死,类似于晚疫病症状。利用TA克隆技术从致病疫霉菌XH05-5-4中克隆得到了1个半胱氨酸蛋白酶家族基因（登录号：KP938956命名：C1A-PH-SCH1）,通过同源性比对发现C1A-PH-SCH1为木瓜蛋白酶亚家族基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了表达,对生物活性测定结果显示出现了类似于晚疫病症状的水渍坏死斑症状,推测C1A-PH-SCH1参与马铃薯晚疫病的发病过程。 相似文献