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针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(12):2030-2034
采用RT-PCR技术从牛肾细胞中扩增出Mx1基因,构建牛Mx1基因过表达重组载体;针对牛Mx1mRNA序列设计shRNA引物对,构建针对牛Mx1的RNAi载体。将牛Mx1的过表达载体和RNAi载体共转染293T细胞,利用Western blot方法检测牛Mx1蛋白的表达情况,筛选有效沉默牛Mx1的shRNA;将有效沉默Mx1的RNAi载体转染牛胎儿气管原代上皮细胞,经流式细胞分选,Western blot检测,获得沉默牛Mx1的稳定细胞系。结果表明,成功构建了牛Mx1过表达重组载体pcDNA3.1-Mx1和RNAi载体RNAi-Mx1A、RNAi-Mx1B、RNAi-Mx1C,筛选到RNAi-Mx1A沉默牛Mx1效果最好;经流式细胞分选和Western blot检测,获得有效沉默牛Mx1的牛胎儿气管原代上皮细胞,为进一步探讨牛Mx1抗病毒作用及机制的研究奠定试验基础。 相似文献
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本研究旨在通过慢病毒载体构建稳定表达真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145细胞系并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。全基因合成eIF5A序列，双酶切后构建慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro。将该载体和慢病毒包装质粒psPAX2与包膜蛋白质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞，包装得到能表达eIF5A的慢病毒。将慢病毒转导至MARC-145细胞，经过嘌呤霉素筛选、细胞有限稀释法获得能稳定表达eIF5A的MARC-145细胞系。MTS试验证实构建的细胞系细胞活力无显著变化，病毒TCID50测定、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和间接免疫荧光技术检测eIF5A稳定表达对PRRSV滴度、PRRSV N基因及N蛋白表达的影响，发现MARC-145-eIF5A细胞系能显著促进PRRSV的增殖。本研究成功构建了稳定表达eIF5A的细胞系MARC-145-eIF5A,PRRSV感染试验证实体外稳定表达eIF5A可以促进PRRSV在MARC-145细胞的... 相似文献
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为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）核衣壳（N）蛋白的非洲绿猴肾（Vero）细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2015,(4)
髓性分化因子88(MyD88)作为TLRs/IL-1R信号通路中重要的接头蛋白,在免疫应答和疾病防御中起重要作用,作者拟通过慢病毒介导的RNA干扰技术获得MyD88基因沉默的猪小肠上皮细胞,为致病菌引起肠道疾病机制研究提供有效模型。共构建4个靶向猪MyD88基因的shRNA表达载体和1个MyD88基因高表达载体,通过实时荧光定量PCR方法鉴定瞬时共转染293细胞中MyD88基因转录水平,筛选获得干扰猪MyD88基因效率最高的shRNA表达载体,将其包装成慢病毒载体,用于建立MyD88基因稳定沉默的猪小肠上皮细胞。最终成功获得MyD88基因沉默效率达到69.3%的小肠上皮细胞,达到基因功能分析的要求。MyD88基因稳定沉默猪肠上皮细胞的获得,为猪肠道病原微生物所引起的TLRs/IL-1R信号通路作用机制的研究提供了宝贵材料。 相似文献
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针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。 相似文献
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猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。 相似文献
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针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。 相似文献
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构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。 相似文献
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旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。 相似文献
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旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础. 相似文献
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《中国动物传染病学报》2017,(4)
SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(6)
为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。 相似文献
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利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系，分析稳转细胞系的自噬水平和活力，为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体，转染至293T细胞，获得慢病毒颗粒，将病毒颗粒感染B16F10细胞，通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果，Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况，CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明，成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA，纯化的慢病毒滴度为1×108 TU·mL-1，建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制，mRNA的沉默效率约为75%（P<0.01），发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量，降低B16F10细胞活力。以上结果表明，干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性，促进B16F10细胞死亡，这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。 相似文献
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研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(2):249-251
为了建立ERβ1293的稳定表达细胞系,为ERβ1293的功能研究奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ1293为模板,扩增出全长ERβ1293,经胶回收纯化后连接到pMD18-T Vector,经测序鉴定后双酶切连接至Lenti-OE-Flag载体,重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定;使用HEK-293T包装细胞系,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系,并采用Western blot方法验证基因表达情况。结果获得了Lenti-OE-Flag-ERβ1293重组质粒,并成功包装成慢病毒。利用病毒感染HEK293细胞后获得了稳定表达细胞系,Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ1293蛋白,为研究ERβ1293的功能奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(12):2126-2129
通过构建比格犬ERβ稳定细胞系及其配体结合区(LBD)的真核表达载体,为探讨ERβ的功能奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ为模板,扩增出全长ERβ以及ERβ-LBD基因片段,经胶回收纯化后连接到pMD18-T载体,经测序鉴定后再连接至Lenti-OE-Flag以及pFLAG-CMV4载体。使用HEK-293T包装细胞系,包装Lenti-OEFlag-ERβ产生慢病毒,并将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系。同时将pFLAG-CMV4-ERβ-LBD质粒瞬时转染293T细胞,采用Western blot方法验证ERβ以及ERβ-LBD蛋白的表达情况。结果表明,试验成功获得ERβ稳定表达细胞系和重组质粒pFLAG-CMV4-ERβ-LBD;Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ蛋白,ERβ-LBD也可以瞬时成功表达。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(12):2277-2281
为揭示转导蛋白(β)样1X连接受体1(TBL1XR1)对水疱性口炎病毒(VSV)复制的影响,首先设计并构建沉默TBL1XR1的shRNA表达载体,并以其作为包装慢病毒的穿梭质粒,同骨架质粒共转染239T细胞后,成功包装出表达shTBL1XR1的慢病毒颗粒。以慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7并建立TBL1XR1表达沉默的细胞系,同时构建不靶向任何基因的对照细胞系。最后,用VSV感染TBL1XR1沉默细胞系,并通过荧光定量PCR方法检测VSV的复制能力。结果发现,对TBL1XR1进行沉默能显著抑制VSV的复制,推测TBL1XR1及其相关复合物在VSV侵染过程中起到了一定的辅助作用。研究结果不仅为揭示VSV的致病机理奠定基础,也对VSV的疫病防控起到一定的指导作用。 相似文献