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自山东寿光地区疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织中分离到一株鸭肝炎病毒,命名为SG株DHV-Ⅰ.该病毒能被DHV-Ⅰ标准抗血清中和,该病毒第5代病毒尿囊液对12日龄鸭胚的ELD50为10-5.58/0.2 mL,对7日龄雏鸭的LD50为10-4.68/0.2 mL.全基因组序列比较分析发现,SG株DHV-Ⅰ基因组结构为5' UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3' UTR,与A型DHV-Ⅰ毒株的核苷酸同源性为94.9%～99.7%,氨基酸同源性为94.5%～99.7%,表明SG株DHV为一株A型DHV-Ⅰ强毒. 相似文献
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鸭病毒性肝炎病毒分离鉴定及VP1基因序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
应用无母源抗体的鸭胚从疑似病毒性鸭肝炎的病麻鸭肝脏中分离到1株病毒。该分离毒能致死鸡胚、番鸭胚和麻鸭胚,死胚尿囊液均无血凝性;病毒能被鸭病毒性肝炎高免血清特异性中和;病毒人工感染3日龄麻鸭发病率和死亡率均达50%,并从病死鸭肝脏中回收到分离毒;RT-PCR扩增结果表明分离毒为I型DHV阳性,同时将此扩增的1 052 bp目的片段克隆到pMD18-T载体,对重组阳性质粒进行序列测定和分析表明分离毒的VP1基因与台湾省分离株DHV-03D的亲缘关系最近,同源率为95.7%,对VP1氨基酸潜在位点分析发现该分离毒具有野毒的分子特征。上述结果表明该分离毒为Ⅰ型鸭肝炎病毒,命名为DHV-NA株。 相似文献
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Ⅰ型鸭病毒性肝炎RT-PCR检测方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ/06强毒株的测序结果,在其基因组3D基因区设计合成一对可扩增238 bp的特异性引物,成功的建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了其特异性与敏感性,对DHV-Ⅰ分离毒株和临床病料进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原:鸭瘟病毒、鸭产蛋综合症病毒、鸭副粘病毒、鸭里默氏杆菌均未扩增到任何片断。利用BHK-21细胞、SPF鸡胚对DHV-Ⅰ临床病料进行病毒分离鉴定,结果表明建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点。 相似文献
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鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列设计、合成引物,以山东、江苏、广东等地分离株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到预期大小的目的片段.将山东分离株扩增的目的片段克隆到pGM-T载体,酶切鉴定得到阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,与参考毒株R85952的序列比较发现,山东分离株与参考序列的同源性为974%.试验结果表明,所建立的RT-PCR方法最低模板检出量为100 pg,且该方法只能特异地检测出DHV,不能检出鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒和番鸭细小病毒等.自然感染病料的检测分离结果表明,该方法既可用于DHV-Ⅰ分离株的快速鉴定,也可用于临床感染病例的检测与诊断. 相似文献
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根据Genebank上已报道的鸭肝炎病毒Ⅰ型基因的全长序列,设计了1对引物,通过RT-PCR方法扩增出特异的DHV-Ⅰ基因片段;将该片段克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌Rosetta-gami(DE3),并用IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,获得了表观分子量在20kD左右的融合表达蛋白;将表达纯化后的蛋白作为抗原,免疫BALB/c健康小鼠,筛选和制备了1株DHV-Ⅰ单克隆抗体细胞株。Western-blot及ELISA分析表明:表达的重组蛋白均能与鸭DHV-Ⅰ阳性血清和制备的DHV-Ⅰ单克隆抗体产生反应。同时,制备的DHV-Ⅰ单克隆抗体除了能与重组蛋白反应,还能识别天然的DHV-Ⅰ病毒蛋白。 相似文献
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Ⅰ型鸭肝炎病毒F株基因组测序及其结构分析 总被引：2，自引：0，他引：2
通过鸭肝炎病毒F株的测序分析研究了鸭肝炎病毒基因组间的变异情况,为鸭肝炎病毒病的防治提供线索.结果表明DHV-F具有DHV-Ⅰ所具有的基本特征此外还有如下特点:1)DHV-F 5′UTR含有8个茎环结构,且有2个GNRA基序、A/C富含区、U/C富含区、A富含环和U富含环;2)2C蛋白基序DDLxQ中的亮氨酸被苯丙氨酸(192～196 aa)所替代;3)3D蛋白基序PSG中的脯氨酸被半胱氨酸(280～282 aa)所替代;4)预测表明3D蛋白具有"指、拇指和掌"的空间构象,且具有一个大的开放性的中间槽;5)3D蛋白所有保守基序位于蛋白亚基的内层;6)DHV-F的多聚蛋白P2和P3与DHV-Ⅰ的相应蛋白片段有较高的同源性,而与P1的同源性相对较低.说明鸭肝炎病毒DHV-F有抗原性变异. 相似文献
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To determine the genomic sequence of a duck hepatitis virus type 1 (DHV-1) strain,real-time quantitative polyrnerase chain reaction (RTQ-PCR) assay based on SYBR Green Ⅰ technology was developed to target 3D gene of DHV-1.Comparative sequence analysis showed that the genome has a typical picornarivus genetic organization,and strain DHV-1 R genetic organaiztion is 5' untranslated region (UTR)-VPO-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3' UTR,DHV-1 R has close relationship with Parechovirus,and has 95.1-99.1% nucleotide sequence identity with other DHV-1 strains.Based on the DHV-1 sequences in GenBank,three pairs of specific primers were designed to amplify DHV-1 using real-time PCR.The results showed that real-time PCR Tm value is 85.6℃ and the real-time PCR provides a broad dynamic range,detecting from 102 to 109 copies of DHV-1 cDNA per reaction.No cross-reactions were found in specimens containing DPV,AIV and NDV.It is concluded that DHV-1 belongs to a new group of the family Picornaviridae that may form a separate genus most closely related to the genus Parechovirus.All results showed that the real-time PCR has high sensitivity and specificity to detect DHV-1 using SYBR Green Ⅰ dissociation curve analysis,isolates can be distinguished by their melting temperature.These methods are rapid,sensitive,and reliable,and can be readily adapted for detection of DHV-1 from other clinical samples. 相似文献
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为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。 相似文献
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1型鸭肝炎病毒R株全基因组分析与检测技术的研究 总被引：6，自引：0，他引：6
【目的】测定1型鸭肝炎病毒（DHV1）毒株R全基因组,建立鸭肝炎病毒1型巢式PCR与实时荧光定量RT-PCR。【方法】设计特异性引物测定DHV1毒株R全基因组,以3D为靶基因序列的引物P1和P2,P3 和P4进行巢式PCR,引物F和R进行实时荧光定量RT-PCR。【结果】序列分析发现该毒株与其它GenBank上发表的DHV1毒株基因组核苷酸序列同源性为94.2%～99.2%,编码聚合蛋白氨基酸序列同源性为98%～98.8%,表明DHV1-R株与其它DHV1毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。基因组结构5′UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C- 3A-3B-3C-3D-3′UTR在遗传进化关系上与副肠孤病毒属（Parechovirus）亲缘关系较近。参照鸭肝炎病毒1型基因序列设计特异性引物,分别进行巢式PCR和SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR 方法检测鸭肝炎病毒1型, 结果表明巢式PCR敏感性为6 pg•ml-1。实时荧光定量RT-PCR确定特异性产物的Tm值,同时做普通RT-PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为85.6℃,最低能检测到含0.015 fg•μl-1 阳性质粒标准品。【结论】建立的巢式PCR与SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR 检测方法显示了较好的特异性、敏感性,为鸭肝炎病毒1型的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。 相似文献
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水禽源禽1型副黏病毒强毒RT-PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
参照GenBank上登录的水禽源禽1型副黏病毒强毒株F基因序列设计引物,建立检测水禽源禽1型副黏病毒强毒株的RT-PCR方法.该方法能从水禽源禽1型副黏病毒强毒株扩增出1条400 bp的特异片段,从水禽源禽1型副黏病毒弱毒、鸭瘟病毒、鸭1型肝炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性法氏囊病病毒、H9亚型禽流感病毒和禽多杀性巴氏杆菌等均不能扩增出目的片段.敏感性试验显示该RT-PCR方法最低可检测出10 pg的病毒核酸.因此,该RT-PCR方法可用于水禽源禽1型副黏病毒强毒的临床诊断. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2基因缺失株RT-PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：1，他引：2
为了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) nsp2基因缺失流行株,在对不同PRRSV分离株nsp2基因核苷酸序列分析的基础上,设计了针对nsp2基因的1对兼并PCR引物和1条基因特异性反转录引物.RT-PCR试验结果表明,经典PRRSV S1毒株和高致病性nsp2缺失株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别为768 bp和678 bp.特异性试验和敏感性试验证明,该检测方法特异性较好,但敏感性相对较低,可用于快速鉴别诊断PRRSV nsp2基因缺失毒株和经典PRRSV毒株. 相似文献
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[目的]探讨F18+ETEC分离株的鉴定、菌毛蛋白的提取及菌毛蛋白生物活性的初步验证。[方法]分别以分离株A20、D20为模板进行PCR扩增,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用热抽提法分别提取F18标准株和分离株A20、D20的菌毛蛋白,并分别制备弗氏佐剂苗,免疫产蛋鸡,采用间接ELISA法定期检测母鸡的IgY和血清抗体效价。[结果]采用TSB培养基,37℃摇床培养24 h,分离株和标准株菌毛均获得了良好的表达。分离株A20、D20经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、SDS-PAGE方法鉴定均为F18+ETEC。F18ab分离株和标准株的菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄中IgY效价最高可达1∶25 600,血清中抗体效价高于卵黄中IgY效价,最高可达1∶51 200。[结论]分离株A20、D20均为F18+ETEC,且对产蛋鸡均具有良好的免疫原性。 相似文献
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根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)均未扩增出特异性基因条带,;灵敏度高,试验组将AIV接种SPF鸡胚,培养后的鸡胚尿囊液(AAF)进行10-2稀释后,仍可以检测到其中的AIV。 相似文献
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利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。 相似文献
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河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定 总被引：6，自引：0，他引：6
利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物,以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系p1基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY p1基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。 相似文献
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【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法;序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对,同时对获得的CP基因序列采用Mr Bayes软件的贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现,一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用抗体反应呈阳性;电镜观察结果表明,该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子;Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段,克隆、测序获得长度为680 bp的序列,该序列与已报道的Te MV核苷酸序列一致性最高(98.2%)。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp(命名为BXGFJ-13分离物),与已报道的Te MV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明,13个Te MV分离物共形成3个类群,相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物(KJ789129)先以较高的后验概率聚为一个分支,再与泰国2个分离物(AM409188、AM409187)聚为第2类群(Group II),表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物Te MV-CPf/Te MV-CPr建立的RT-PCR方法,具有良好的特异性,仅能从感染Te MV的西番莲样品上扩增出目的片段,而从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,Bt MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示,该方法能从稀释102倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准,同时结合血清学检测、电镜观察结果,证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有Te MV;建立的特异性RT-PCR方法能够用于Te MV的快速检测。 相似文献