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1.
转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。 相似文献
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转基因油菜RF1的外源基因插入位点分析与事件特异性检测方法研究 总被引：5，自引：1，他引：4
采用基因组步移和巢式PCR方法研究了转基因油菜雄性不育恢复系RF1外源基因插入位点序列特征,并根据此特征建立了RF1转化事件特异性检测方法。从RF1基因组DNA中分离到外源基因插入位点的左边界旁侧序列798bp,包括335bp的插入载体序列和463bp的旁侧基因组序列。根据已发表的RF1右边界旁侧序列的信息,发现外源T-DNA在向油菜基因组整合的过程中,在整合位点处有75bp的基因组序列丢失。根据分离的RF1左边界旁侧序列,建立了RF1事件特异性定性检测方法,扩增片断大小为284bp。利用建立起来的RF1事件特异性定性检测方法可以准确的将转基因油菜RF1与其它的转基因油菜品种区分开,检测灵敏度达到5个拷贝（0.013%）。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因油菜品种RF1的身份识别提供了有效的方法。 相似文献
3.
为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。 相似文献
4.
为进一步分析转AgGlpF基因耐盐转基因大豆E8A7027转化体的分子特征信息并对其进行特异性检测，本研究分离该转化体的旁侧序列并建立其特异性PCR检测体系。基于基因组重测序技术并结合Sanger测序技术，将基因组重测序分析获得的序列信息与参考大豆基因组进行对比，确定E8A7027转化体的T-DNA区在大豆基因组上的插入位点及其5′端和3′端的旁侧序列。根据旁侧序列设计PCR检测引物，并对检测体系的特异性、灵敏度进行实验室内验证。结果显示：转基因大豆E8A7027的整合位点为Chr09染色体的33886331位点，整合方式为单拷贝插入，受体基因组DNA在插入位点缺失了1段58 bp序列，分别获得E8A7027大豆的5′端旁侧序列910 bp和3′端旁侧序列802 bp。根据这两个旁侧序列设计引物建立的PCR检测方法，能够特异性地将E8A7027大豆转化体与其他转基因作物和非转基因大豆区分开，方法的检测灵敏度为0.05%。研究结果可为E8A7027转化体的安全评价和监管检测提供技术支撑。 相似文献
5.
《大豆科学》2020,(1)
转基因作物的T-DNA插入及其与宿主基因组的连接序列构成的侧翼区域,是转基因事件检测的关键组成部分,也是转基因作物开发、评估和监管所必需的。前期研究得到2个携带大豆花叶病毒P3(soybean mosaic virus P3)基因干扰片段的转基因大豆事件,即L13和L104,可显著提高大豆对大豆花叶病毒、大豆花叶坏死病毒和西瓜花叶病毒的抗性,具有较强的光谱性。为了便于对该转基因事件进行监管以及建立事件特异性检测方法,本研究通过Illumina Xten平台,对L13和L104进行全基因组测序(whole genome sequencing,WGS),并结合生物信息学分析和PCR技术,对转基因事件L13和L104的旁侧序列进行了分析。通过全基因组测序,每一个事件获得了超过12.13 Gb的原始数据,测序深度为11×,与大豆参考基因组(Wm82.a2.v1)和转化载体序列做比较,初步识别出这两个转化事件T-DNA的边界及其旁侧序列。转化事件L13和L104的T-DNA分别位于Chr04和Chr11染色体上。进一步的PCR检测和序列测定表明转基因事件L13的T-DNA为单位点双拷贝整合到大豆基因组Chr04:46747946位点;转基因事件L104的T-DNA为单拷贝插入,整合位点为Chr11:30461895位点。结果证明了全基因组测序在识别转基因作物T-DNA插入和旁侧序列区域方面的有效性和稳定性。此外,插入位点的鉴定和事件特异性检测的建立将有助于广谱抗病毒转基因大豆品种的应用和发展。 相似文献
6.
HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。 相似文献
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第二代抗草甘膦大豆PCR检测方法研究 总被引：10，自引：0，他引：10
为建立转基因大豆Roundup RReady2Yield"(RR2Y)转化体特异性定性PCR检测方法,以lectin基因作为内参照基因,根据RR2Y外源插入片段5'端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,从RR2Y中特异性地扩增出223bp的预期产物.对该方法进行重现性、特异性、灵敏度、稳定性和可重复性测试,结果显示:陔方法能够特异性检测出RR2Y转化体;将100%RR2Y基因组DNA用A3244基因组DNA进行梯度稀释,以100 ng DNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝;以RR2Y DNA含量为10%、1%、0.1%的样品为模板,进行稳定性和可重复性,假阴性率为0.结果表明:此方法适用于RR2Y的转化体特异性定性PCR检测. 相似文献
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抗虫玉米MON89034转化体特异性PCR检测技术研究 总被引：5，自引：2，他引：3
根据抗虫玉米MON89034外源插入片段5’端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,预期产物大小为455 bp。以zSSIIb基因作为内标准基因,建立了转基因玉米MON89034转化体特异性定性PCR检测方法。对该方法进行重现性、特异性和灵敏度测试,结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034转化体,以100 ngDNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.1%,约为40个起始模板拷贝。复合PCR检测结果还表明,在同一PCR反应管中可实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测。 相似文献
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为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
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为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明，它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时，为了获得侧翼序列，分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增，确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列，明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置，也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
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检测小麦线条花叶病毒的TaqMan MGB探针技术 总被引：1，自引：0，他引：1
为给小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)的灵敏、稳定、快速检测提供依据,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了WSMV的实时荧光RT-PCR检测方法.结果表明,本研究设计的TaqMan MGB荧光探针对WSMV的检测具有很好的特异性,解决了因病毒不同分离物之间基因组变异较大、难以找到长片段保守序列来设计探针的困难.该方法无需任何PCR后处理.基因污染风险小.它与双抗体夹心酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高1 000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合于WSMV的快速检测. 相似文献
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利用经PCR、GUS染色和Southern杂交均证明已成功转入Hb CBF1的、田间表型为矮化的橡胶树植株C1为材料,通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA右侧侧翼序列1.6 kb,根据侧翼序列与载体的序列设计引物分析验证该序列真实可靠,并设计引物判断基因的T-DNA插入以杂合位点存在,与此同时,将该侧翼序列与已有的橡胶树基因组测序结果进行比对分析,发现该插入位点处并不存在基因,根据CBF1与Ca MV35s启动子的研究推测,C1植株的矮化表型是由于Ca MV35s启动子驱动抗逆基因导致,而非插入基因造成。 相似文献
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拟南芥春化基因vrn2的克隆及相关分析 总被引：2，自引：0，他引：2
进行了拟南芥春化基因vrn2(Vernalization2)在拟南芥和唐菖蒲基因组DNA分子上的定位研究。以拟南芥(Arabidopsis thaliana L．)为材料，根据已报道的vrn2基因序列，设计并合成一对特异引物，通过PCR方法扩增出全长3154bp的特异片段。Southern杂交结果表明，在拟南芥基因组中，用HindⅢ酶切消化的DNA在约9．0Kb处有一条杂交带，用BamHI酶切消化的DNA在约2．5Kb处有杂交信号，在唐菖蒲基因组中，用HindⅢ酶切消化的DNA在约2．7Kb处有杂交信号出现。杂交结果说明vrn2在拟南芥基因组中是单拷贝基因，在唐菖蒲基因组中也含有此基因或是具有与vrn2同源的序列。 相似文献
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银松素合酶（pinosylvin synthase,PS）是合成银松素类植物抗毒素的关键酶。本文根据前期工作所获得的PS基因序列,设计基因特异引物,利用连接介导的染色体步行技术,从马尾松总基因组中扩增PS基因上游的启动子区;通过PLAN-CARE等分析软件对5′侧翼区近700 bp进行启动子特征分析,预测启动子区调控元件。结果表明,在翻译起始密码子上游167 nt处可能存在TATA-box。此外还发现3个GATA-box（-260 nt、-295 nt、-386 nt和-295 nt）和若干个TGAC-like序列。 相似文献
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甜椒脉斑驳病毒（PVMV）在海南的发现与检测 总被引：1，自引：0，他引：1
2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到pMD18-T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明：该条带序列（包含部分NIb和部分cp基因）与已收录的甜椒脉斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）（GenBank登录号：FM202327）序列相似性最高,达99％。设计cp基因的特异引物,对上述样品进行cp基因扩增并构建以cp基因序列为基础的系统进化树,发现海南辣椒上的PVMV与台湾的PVMV分离物ns1株同源性最高。田间检测结果表明：海南黄灯笼辣椒上PVMV的检出率高达74.07％,说明PVMV可能成为海南辣椒生产上的潜在威胁。 相似文献
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实时定量荧光PCR法检测马铃薯黑胫病菌 总被引：1，自引：0，他引：1
马铃薯黑胫病是国内外马铃薯产区发生比较普遍的一种细菌性病害,严重地影响了马铃薯的产量和质量。本研究根据Potato Black Leg序列,设计出马铃薯黑胫病菌特异性的引物,对10种供试菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,该方法的特异性好,可以将马铃薯黑胫病菌和其它马铃薯常见病害相区分;灵敏度较高,可检测出最低的黑胫病菌浓度为3.6~3.9 cfu.mL-1;而且检测时间仅用4 h,大大缩短了检测周期。该方法可有效地应用于马铃薯黑胫病菌的检测和监控。 相似文献
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To construct the T-DNA insertional mutagenesis transformation system for rice sheath blight pathogen Rhizoctonia solani AG-1 IA,the virulent isolate GD118 of this pathogen was selected as an initial isolate for transformation.The conditions for transformation of isolate GD118 were optimized in five aspects,i.e.pre-induction time,co-culture time,acetosyringone(AS) concentration at the co-culture phase,co-culture temperature and pH value of induction solid medium(ISM) at the co-culture phase.Finally,a system ... 相似文献