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1.
[目的]建立一种快速检测猪、牛、羊动物源性成分的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。[方法]针对猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因分别设计LAMP引物,通过实时检测荧光强度判断反应结果。[结果]猪、羊源性成分的检测灵敏度为10 pg,牛源性成分的检测灵敏度为1 pg。对模拟掺杂肉制品检测时,掺杂猪肉、牛肉、羊肉的检出限为0.01%。[结论]该研究所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对肉制品掺杂的猪、牛、羊源性成分进行检测,可作为肉类鉴别的一种快速检测方法。 相似文献
2.
副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。 相似文献
3.
[目的]比较不同聚合酶链式反应(PCR)技术在食品源性分析中的应用,分析引物、荧光染料和探针的特点及其发展前景。[方法]介绍PCR、荧光定量PCR技术,比较该技术及荧光标记基团的特性,及其在食品源性成分鉴定方面的实际应用。[结果]通过完善DNA提取方法、优化反应体系、设计特异性引物或探针均能有效提高PCR检测的灵敏度及准确性。[结论]采用PCR、荧光定量PCR技术能有效地实现食品中源性成分鉴定,且方法具有高灵敏度、高特异性、高效率等优势,能满足实验室对食品中源性成分的检测分析。 相似文献
4.
[目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同浓度下扩增曲线,分析检测方法的灵敏度。以牛源性DNA稀释液为模板,进行10个平行扩增试验,分析检测方法的精密度。[结果]该研究所用的引物和探针对牛源性DNA具有明显的扩增曲线,而对非牛源性(鸡、鸭、猪、人)DNA模板不进行扩增。灵敏度分析结果显示,该检测方法对浓度仅为24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍进行阳性扩增。精密度分析显示,10个平行试验扩增曲线相似,Ct值的标准差(SD)仅为0.41,精密度(CV)也仅为1.6%。[结论]该研究开发的牛肉成分检测的荧光实时定量方法特异性高,仅对牛源性DNA发生扩增。同时该方法灵敏度也很好,检出限为24.4 pg/μL,精密度也很高,重复性良好,适用于市场上肉制品中牛源性成分的检测。 相似文献
5.
[目的]为完善我国转基因检测方法体系,建立转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction, PCR)检测方法。[方法]根据MON87751的3′端邻接区序列设计特异性引物和探针,建立MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法,并测定该方法的灵敏度、特异性及可重复性。[结果]灵敏度测试显示,其定量下限为40拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。[结论]该研究建立的MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性良好,灵敏度高,有良好的可重复性,适合对转基因大豆MON87751品系进行检测鉴定。 相似文献
6.
肉制品中鸡源性成分重组酶介导等温扩增检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了快速准确检测出肉制品中的鸡源性成分,本研究基于鸡线粒体细胞色素B基因(CytB),设计特异性引物和exo探针,建立了实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)方法,进行特异性、灵敏性和稳定性分析,并通过检测市售肉制品对所建立RAA方法的准确性和适用性进行分析。结果表明,该方法可以快速实现对高山鸡肉、乌鸡肉、芦花鸡肉、白羽鸡肉和野鸡肉基因组DNA的特异性扩增,而对猪肉、牛肉、羊肉等的DNA均没有扩增,可稳定检出的鸡源性成分最低质量分数为0.1%。在9份标识有鸡肉成分的市售样品中,7份检出鸡源性成分,有2份样品的鸡源性成分检测结果为阴性。本研究建立的实时荧光RAA方法操作简单,反应迅速,特异性强,灵敏度高,为肉制品中鸡源性成分的检测提供了技术保障。 相似文献
7.
【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)~(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。 相似文献
8.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(9)
[目的]建立检测产志贺毒素性大肠杆菌(STEC)stx2基因荧光定量PCR方法。[方法]根据GenBank中已发表的STEC stx2基因序列,在保守区域设计PCR引物和探针,构建重组质粒作为阳性模板,优化反应条件,建立荧光定量PCR方法。[结果]利用优化的荧光定量PCR反应体系建立了标准曲线。表明起始模板浓度与Ct值之间线性关系好,相关系数R2均达0.995以上;此方法特异性好,对10种非STEC肠道病菌无特异性扩增;敏感性高,初始模板的检出下限达1.0×102拷贝数/μl;重复性好,批内、指间变异系数均分别小于1%和5%。[结论]该研究成功建立了检测STEC stx2基因的荧光定量PCR方法,为快速检测样品中STEC提供了技术手段。 相似文献
9.
本研究建立1种基于TaqMan探针的实时荧光环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）(TaqMan—LAMP)检测方法,用于肉制品中鸭源性成分的快速鉴别。以鸭线粒体cytb基因的保守序列设计特异性引物,优化并建立基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测方法,对该方法进行特异性、灵敏度试验;同时与《GB/T38164—2019常见畜禽动物源成分检测方法 实时荧光PCR法》作比较,对市售肉制品进行检测,验证本方法的准确性。所建立的TaqMan-LAMP检测方法特异性强,仅鸭肉基因组DNA呈现特异性扩增曲线,30 min内完成检测,灵敏度为0.001%(w/w),重复性好,批次内变异系数CV为1.99%,对47份肉制品进行检测,检测结果与国标法相比,相对敏感性、特异性和符合率均为100%。本研究建立的鸭源性成分TaqMan-LAMP检测方法检测快速、特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于肉制品中鸭源性成分的快速检测。 相似文献
10.
[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台. 相似文献
11.
马铃薯早疫病主要是由茄链格孢(Alternaria solani)引起的一种常见真菌性病害。本试验依据GenBank中链格孢属的ITS序列(Internal Transcribed Spacer),设计并合成了1对特异性引物ptAsQ-F(5′-TTTGCAATGGCAATCAGCG-3′)/ptAs-R(5′-CCCGCAAG-GGGAGACAAA-3′),以重组质粒为标准品构建实时荧光定量标准曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法,引物特异性好,灵敏度高。重复性试验表明,组内和组间变异系数均小于2.51%,显示该方法具有较好的检测稳定性。利用该定量检测技术,可以检测出潜伏侵染于叶片和土壤中的早疫病菌。该方法为马铃薯早疫病田间发病的动态监测以及指导高效防控措施提供了技术支持。 相似文献
12.
《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2020,(2)
利用TaqMan微流控阵列(TaqMan~? array microfluidic card)技术,将24种(类)动物物种的实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)的引物探针集合在同一个阵列上,以实现多物种高通量同步检测,并对该方法的重复性、特异性和灵敏度进行验证。用变异系数(coefficient of variation, CV)表示一块阵列板内,同一物种成分检测的重复性。结果显示:66个CV值中,11个低于1%,15个大于2%,其余40个介于1%～2%之间,没有一个物种成分的CV值高于3%。P值显示的是不同阵列板间同一成分检测的重复性,22个物种成分的P值只有1个小于0.05,显示为板间存在差异,其他21种成分的板间差异均未达到显著水平。因此,本研究对多数物种成分的检测,不论板内还是板间都有较好的重复性。特异性检测中未发现TaqMan微流控阵列中出现假阳性的结果,但有2种成分的检测出现了假阴性。TaqMan微流控阵列的检测灵敏度没有高于单重荧光定量PCR,在22个检测样品中,10个物种成分检测的灵敏度降为原来的10%,1个甚至降低为原来的1%,其余11个灵敏度和单重荧光保持一致。总体而言,TaqMan微流控阵列技术在重复性、特异性和灵敏度方面都能满足物种成分真伪鉴定的需求,为同步鉴定多种动物源性成分提供了一种新的方法。 相似文献
13.
[目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。[结果]该试验建立的荧光定量PCR方法在102~1010拷贝/μl之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%~110%之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝,敏感性较高,而且特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3%,表明该方法的重复性较好。应用该方法可以对疫苗的免疫效力进行定量检测和评价,也可以对临床病料进行检测。[结论]该研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可为TGEV的流行病学调查、疫苗开发和发病机制等研究提供可靠的工具。 相似文献
14.
[目的]通过设计特异性引物与荧光探针,建立马达加斯加龙树（Didierea madagascariensis）实时荧光定量PCR鉴定方法。[方法]提取26份龙树科植物基因组,并用内源基因检测DNA质量;根据GenBank中已发表的马达加斯加龙树的PEPC基因序列,设计特异性引物与荧光探针,通过检测26份供试样本,检测该方法的特异性;将样品DNA进行10倍梯度稀释,以检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度。[结果]只有3份马达加斯加龙树样本出现典型的扩增曲线,其他23份龙树科植物无典型的扩增曲线;核酸原液与10-1～10-4倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线,标准曲线的决定系数（R2）为0.995,检测限量为5.2×10-3 ng/μL。[结论]该方法特异性强、灵敏度高,可有效地应用于马达加斯加龙树的鉴定。 相似文献
15.
[目的]设计用于扩增地中海实蝇的特异性引物,建立快速、灵敏检测地中海实蝇的实时荧光PCR方法.[方法]采用实蝇科昆虫线粒体DNA COI基因的通用引物扩增地中海实蝇以及其它三种供试实蝇的DNA片段,经测序、比对分析,设计出扩增地中海实蝇的特异性引物,用SYBR Green实时荧光PCR方法验证该引物的特异性与灵敏度.[结果]设计的引物对DZH-F/DZH-R能特异性检测出地中海实蝇,扩增产物的溶解曲线峰值Tm为79.2.该对引物检测地中海实蝇的灵敏度为10-3 ng/μL.[结论]所建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法检测地中海实蝇特异性强、灵敏度高. 相似文献
16.
17.
[目的]建立针对黏菌素耐药基因mcr-1的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持.[方法]针对mcr-1基因保守序列设计特异性引物和MGB探针,构建重组质粒作为阳性标准品,优化引物、探针浓度及Rox参比染料用量、退火温度等反应条件,建立针对mcr-1基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性.[结果]TaqMan-MGB荧光定量PCR最佳反应体系20.00μL:Premix Ex TaqTM 10.00μL,Rox参比染料(50×)0.25μL,引物MCR-1F/MCR-1R(10μmol/L)各0.50μL,MCR-1-P探针(10μmol/L)0.50μL,重组质粒pMCR-1(模板)2.00μL,灭菌双蒸水6.25μL.扩增程序:95℃预变性20 s;95℃10 s,60℃20 s,进行40个循环.该检测方法能特异性扩增出mcr-1基因,其检测敏感性为2.85拷贝/μL,是常规PCR的100倍,组内和组间重复性试验的变异系数为0.37%~1.18%,均小于1.20%.采用建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR对82株广西鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果未发现有携带mcr-1基因的菌株.[结论]针对mcr-1基因建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于临床筛查mcr-1基因,为监控mcr-1基因携带细菌提供技术支持. 相似文献
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实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。 相似文献
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[目的]建立快速检测宠物食品中沙门氏菌(Salmonella)的荧光定量PCR方法。[方法]根据Genbank中登录的沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因序列设计合成引物和探针,检测该方法的特异性和敏感性。[结果]该方法具有良好的特异性,对沙门氏菌的检测灵敏度可达到17 CFU/反应(25μl/反应)。应用该方法检测人工污染宠物食品,样品经18 h增菌后,结果均为阳性。[结论]该研究建立的Taqman荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测宠物食品中的沙门氏菌。 相似文献
20.
《上海农业学报》2016,(5)
以我国口岸重点监控的转基因棉花T304-40品系为研究对象,根据其外源插入片段与基因组DNA3'端邻接区序列设计引物和探针,经筛选和优化后,建立了转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。对方法的适用性测试结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法高度特异于转基因棉花T304-40品系检测,反应效率达94.2%,绝对灵敏度为20拷贝基因组DNA,定量下限为25拷贝基因组DNA。以研制的检测方法建立标准曲线对盲样进行定量分析,结果表明4个盲样的测定值与设定值间的偏差均小于10%。因此,本研究建立的转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可准确地对棉花及其制品中转基因棉花T304-40成分进行定性或定量检测分析。 相似文献