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1.
家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析 总被引：2，自引：2，他引：0
细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。 相似文献
2.
家蚕细胞周期素E基因在5龄幼虫组织表达的剪切变体和表达谱特征 总被引：2，自引：2，他引：0
细胞周期素E(cyclinE)是调控细胞周期从G1期进入S期的关键因子。利用家蚕基因组数据库信息设计引物,克隆家蚕cyclinE在5龄幼虫不同组织表达的cDNA序列,获得该基因的6种不同剪切变体,这6种剪切变体前4个外显子和最后一个外显子都相同,变化主要集中在第5~7外显子处。同源性比对显示,不同物种来源的cyclinE周期蛋白盒区域具有较高的保守性,有35个氨基酸的共同保守序列,该区域可能也是家蚕cyclinE的特异识别并结合细胞周期素依赖蛋白激酶的功能区域。利用实时定量PCR分析显示,cyclinE在家蚕5龄第3天幼虫的中肠、脂肪体、丝腺、脑、马氏管、精巢、卵巢、血液等8种组织、器官中均有表达,并且在脂肪体中的表达相对较高,推测cyclinE基因在家蚕脂肪体细胞分裂过程中发挥重要作用。 相似文献
3.
本文采用半定量RT-PCR方法,检测了家蚕4～5龄期丝腺中5个丝蛋白基因(Fib-H、Fib-L、Ser-2短片段、Ser-2长片段、Ser-3)在不同发育时期表达量的变化。结果表明,Fib-H、FIB-L及Ser-3基因的表达规律相似,总体上4龄期表达量明显低于5龄,但4龄眠期均有明显表达,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,至熟蚕或熟蚕后2d达到高峰,此后迅速下降;Ser-2基因两个转录本的表达规律基本一致,与以上3个基因相比,Ser-2基因在4龄期存在相对较高的表达量,但在4龄眠期表达量明显降低,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,Ser-2短片段和长片段分别从5龄96h和144h之后表达量开始降低,到熟蚕期基本达到最低值。 相似文献
4.
昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。 相似文献
5.
亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。 相似文献
6.
采用Clontech公司SMARTTM技术,分别构建了家蚕4龄眠蚕后部丝腺(PSG0)以及5龄第3天后部丝腺(PSG3)、中部丝腺(MSG3)和脂肪体(FAT3)的Matchmaker cDNA文库,用A3基因引物对几个文库的质量进行了检测;从cDNA文库和家蚕基因组中克隆了FMBP-1、POU-M1和BmFkh 3种在蚕丝蛋白基因表达调控中起重要作用的转录因子编码区,并对其序列进行了分析。结果表明,所建cDNA文库能够用于利用酵母的杂交系统开展蚕丝蛋白基因的表达调控研究。 相似文献
7.
杀虫剂辛硫磷诱导家蚕脂肪体蛋白的表达特征及SerB基因的组织转录活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了从蛋白质水平探讨家蚕对有机磷杀虫剂的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术,分析家蚕5龄中期幼虫在添食杀虫剂辛硫磷前后脂肪体蛋白的表达特征。经ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到465个蛋白点,实验组检测到396个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有348对,匹配率为73.54%。对特征蛋白进行质谱分析,已鉴定的蛋白包括磷酸丝氨酸转氨酶(SerB)和5'-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。采用半定量RT-PCR分析家蚕5龄幼虫添食辛硫磷后脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管等6个组织器官中SerB基因mRNA的转录水平,结果与对照组相比均呈现上调趋势,其中在脑组织的转录水平上调尤为明显,在脂肪体中的转录水平上调与其蛋白的表达上调一致。受辛硫磷诱导的影响,家蚕5龄中期幼虫脂肪体的蛋白数目减少,SerB基因在各组织器官增量表达,推测可能与蚕体对农药的代谢解毒作用有关。 相似文献
8.
脂围蛋白(perilipin)与脂肪细胞脂类代谢的调节有关。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA开放阅读框(ORF)序列长度为918 bp的基因,预测其编码305个氨基酸残基,蛋白分子质量约32.5 kD。经NCBI比对发现该蛋白具有部分脂围蛋白的保守结构域,因此将该ORF序列命名为BmPLIN基因。将该基因插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmPLIN,并转化大肠杆菌中进行原核表达得到带有His标签的融合蛋白,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。用纯化后的融合蛋白为抗原免疫大白兔获得多克隆抗体,ELISA间接法测定抗体的效价达到1∶12 800以上。通过荧光定量PCR和Western blotting技术对BmPLIN基因及其编码蛋白在家蚕5龄幼虫各个组织器官中的转录、表达水平进行分析的结果是:BmPLIN基因mRNA在家蚕5龄幼虫各组织器官中的转录水平由高到低依次为生殖腺(卵巢和睾丸)、脂肪体、肠、表皮、头部、马氏管、丝腺、气门,在家蚕5龄幼虫的生殖腺(卵巢和睾丸)中有明显的BmPLIN蛋白特异条带。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞实验的结果显示,BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。 相似文献
9.
为了从蛋白质水平探讨家蚕对菊酯类农药的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,分析家蚕5龄幼虫经氯氰菊酯诱导前后脂肪体蛋白的表达特征。采用ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到432个蛋白点,诱导实验组检测到369个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有342对,匹配率为76.68%。对特征蛋白进行MALDI-TOF-MS分析鉴定的蛋白包括烯醇酶、线粒体醛脱氢酶、伴侣素、肌动蛋白、gag-like蛋白。烯醇酶(enolase)是糖酵解过程中极为重要的酶类。采用半定量RT-PCR对经氯氰菊酯诱导后的家蚕脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、血液等7个组织器官的烯醇酶基因进行表达分析,结果表明,烯醇酶基因转录水平在7个组织器官中都呈现下调趋势,分别下调了13.79%、10.71%、22.48%、7.40%、27.00%、11.50%、14.52%,其中脂肪体的烯醇酶基因表达和蛋白的表达下调一致。受菊酯类农药诱导的影响,家蚕5龄幼虫脂肪体蛋白的数目减少,烯醇酶基因在各组织器官减量表达,提示可能与蚕体的基础生理代谢受到抑制有关。 相似文献
10.
从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。 相似文献
11.
Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。 相似文献
12.
昆虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)主要行使对异生或内源有毒物质进行代谢解毒的功能。选择家蚕谷胱甘肽-S-转移酶E4的编码基因Bmgste4为靶标,研究其组织表达谱、序列结构特征及原核表达重组蛋白的酶活性。RT-PCR检测不同组织表达特征的结果显示,Bmgste4基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、触角、下颚须、表皮、脂肪体、丝腺以及雄性个体的马氏管和雌性个体的卵巢中均有表达,而在血细胞、中肠以及雄性个体的精巢和雌性个体的马氏管中不表达。多序列比对结果显示BmGSTE4具有完整和保守的GST二级结构特征,N端氨基酸残基保守,特别是谷胱甘肽结合位点。构建插入Bmgste4基因开放阅读框片段的重组表达质粒p28-Bmgste4,并转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞进行原核表达后,利用分光光度法测定重组蛋白对通用底物1-氯-2,4-二硝基苯的酶活参数:Km=0.58 mmol/L,Vmax=24.55μmol/(mg.min)。这些结果为进一步研究家蚕体内解毒和抗药性机制以及开发鳞翅目害虫新型生物防治药剂提供了基础信息。 相似文献
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ycaC相关蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族成员。从家蚕蛹cDNA文库中检索到一条EST序列,编码一个含ycaC-related保守结构域的蛋白质,将该cDNA的全长序列命名为BmycaCR(GenBank登录号:GU292794)。通过基因克隆、原核表达和纯化技术得到BmycaCR蛋白,用纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot检测BmycaCR蛋白在家蚕卵期的表达水平明显高于其它发育时期,蛋白质在5龄幼虫的睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血液和丝腺中没有检测到阳性信号。荧光定量PCR检测BmycaCR在家蚕卵期的转录水平明显高于其它发育时期,在5龄幼虫各组织中,BmycaCR的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血液、马氏管、丝腺和头部。亚细胞定位显示BmycaCR蛋白在细胞核和细胞质中均有分布,可能发挥基本的生物学功能,并在靠近质膜区域有强的荧光信号,可能具有与其它蛋白质相互结合的功能。 相似文献
14.
Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)在机体的发育、免疫等生理过程中发挥重要的作用。从家蚕蛹cDNA文库中获得一条全长为728bp的基因序列,对该基因编码的氨基酸序列进行同源性比对,发现其蛋白具有保守的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域(CⅠ-X3-CⅡ-X8-CⅢ-X14-CⅣ-X6-CⅤ-X13-CⅥ),且P1活性位点为赖氨酸(K),因此将该基因命名为BmSPI3(Gen-Bank登录号:DN237641)。通过PCR扩增BmSPI3基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-BmSPI3,并转化到E.coliBL21(DE3)表达,经SDS-PAGE电泳检测在约36kD处有明显的蛋白表达条带。提取各发育时期蚕体和5龄幼虫各个组织的总RNA进行荧光定量PCR,检测结果表明:BmSPI3在5龄幼虫期表达量最高,卵期最低;在5龄幼虫表皮中的表达量最高,在马氏管的表达量最低。推测BmSPI3对胰蛋白酶和类胰蛋白酶具有抑制作用。 相似文献
15.
为探讨有色茧色素物质在蚕体内的代谢机制,检测了有色茧主要色素物质的含量及其在家蚕5龄幼虫不同时期中肠、血液、丝腺组织中的消长变化,分析色素物质从中肠进入血液再转运到丝腺的时序差异。有色茧中,黄茧的色素以类胡萝卜素化合物为主,绿茧的色素以黄酮类化合物为主。黄酮类化合物、类胡萝卜素化合物在家蚕5龄幼虫中肠、血液、中部丝腺、后部丝腺中的含量均呈现龄初低、龄末高的趋势,其中,黄酮类化合物在熟蚕组织中的含量是中肠>血液>中部丝腺>后部丝腺;类胡萝卜素化合物在熟蚕组织中的含量是中部丝腺>后部丝腺>中肠>血液。2种色素物质含量变幅最大的是后部丝腺组织,结黄茧蚕和结绿茧蚕的黄酮类化合物分别增加406.55%、202.50%,类胡萝卜素化合物分别增加211.80%、250.84%。黄酮类化合物在5龄幼虫丝腺组织的绝对含量是结绿茧蚕大于结黄茧蚕,类胡萝卜素化合物在5龄幼虫丝腺组织的绝对含量是结黄茧蚕显著大于结绿茧蚕,与在不同颜色蚕茧中检测到的2种色素物质含量一致。研究结果提示:黄酮类化合物在5龄幼虫中肠组织中积累较多,类胡萝卜素化合物在丝腺组织中积累较多;丝腺组织中2种色素物质的含量与茧色密切相关;来自桑叶中的2种色素物质经中肠消化吸收后,再通过血液进入丝腺组织并产生累积效应。 相似文献
16.
克隆了家蚕苏氨酸脱氢酶基因(Bmtdh),其cDNA长1 310 bp(No.ABA43639.1),包括227 bp 5′-UTR和1 026 bp的完整开放读码框(ORF)。Bmtdh在家蚕基因组上以单拷贝形式存在,编码342个氨基酸,其Ile29-Val322区域是一个完整的表面异构酶功能域。表达谱分析与EST数据的分析表明,Bmtdh在丝腺和卵巢中的转录水平高于其它组织,并且Bmtdh在家蚕4龄眠期、5龄早期的转录水平也很高,而在卵期(G2胚胎)和1龄早期没有检测到其转录表达,表明Bmtdh基因可能参与了蚕丝蛋白的合成过程。 相似文献