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1.
根据GenBank中鸭IFN-α基因(GenBank登录号:JF894229)序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因(GenBank登录号:GU564232)为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法(RT-PCR)。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品(p-IFN-α和p-β-actin),分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99(r>0.99),扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为(93.6±0.26)℃和(85.3±0.15)℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。 相似文献
2.
为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL～1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。 相似文献
3.
《动物医学进展》2015,(11)
为采用SYBR GreenⅠ染料建立检测水貂IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的MiIFN-α和MiIFN-β、MiIFN-γ和3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因序列,分别设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增MiIFN-α、MiIFN-β、MiIFN-γ和MiGAPDH的基因片段,构建到pMD18-T载体中制备质粒标准品,建立了相应基因mRNA的荧光定量RT-PCR检测方法并建立标准曲线。结果表明,MiGAPDH、MiIFN-α和MiIFN-β和MiIFN-γ基因的Ct值与标准品稀释度在10拷贝质粒/μL~107拷贝质粒/μL内均呈良好的线性关系,相关系数(R2)均为1.00,熔解曲线均呈单一熔解峰,检测下限为10拷贝质粒/μL,重复性试验表明组内、组间变异系数均小于4.5%。临床样品检测结果表明水貂感染肠炎病毒后,MiIFN-α、MiIFN-β和MiIFNγ相对表达水平均在6d达到最高峰值,MiIFN-α相对表达量要比MiIFN-β和MiIFN-γ相对表达量高两个数量级,并且在感染期(4d~6d)MiIFN-α相对表达量明显提高。本研究为水貂IFN mRNA的定量分析提供了有效工具。 相似文献
4.
为评价疫苗免疫对鸭细胞免疫应答反应的影响,本研究提取鸭脾脏组织总RNA,采用鸭IFN-γIL-2、GAPDH基因特异性引物,建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)方法.结果显示IFN-γ、IL-2、GAPDH基因扩增标准曲线相关系数均高于0.99;3者扩增效率相近,均接近于100％;融解曲线呈特异性单峰;各基因组内和组间变异系数均小于2％.应用该方法检测不同佐剂禽流感灭活疫苗免疫樱桃谷鸭后脾脏组织IFN-γ和IL-2 mRNA的相对表达水平.结合免疫后抗体水平及攻毒保护结果,比较不同佐剂对禽流感灭活疫苗免疫应答的影响.结果显示,金黄色葡萄球菌毒素A重组蛋白(rSEA)佐剂组IFN-γ和IL-2 mRNA表达水平显著高于其他免疫组(P＜0.05).结果表明,建立的qRT-PCR特异性、重复性和稳定性良好,能够快速、准确检测鸭体内细胞因子的表达水平,为进一步评价疫苗免疫效果奠定了基础. 相似文献
5.
在成功筛选出防治鸭传染性浆膜炎效果较好的中药组方P基础上,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测21日龄雏鸭外周血淋巴细胞(PBMC)IFN-γ和IL-6 mRNA的表达水平,研究该组方对鸭只免疫器官的影响。结果表明,P1组(预防组)鸭脾脏指数和胸腺指数显著或极显著高于y组(阳性对照组)与K组(健康对照组)(P0.05;P0.01),P2组(治疗组)鸭脾脏指数和胸腺指数极显著高于K组(P0.01);P1组极显著提高鸭外周血淋巴细胞IFN-γ mRNA的表达量(P0.01);P2组显著提高IFN-γ mRNA的表达量(P0.05);P1组、P2组IL-6 mRNA的表达量有升高的趋势(P0.1)。说明组方P能促进机体免疫器官的发育和分泌IFN-γ及IL-6,提高机体抗病力和免疫调节能力。 相似文献
6.
7.
为了建立鸭白细胞介素-1β(IL-1β)基因的实时荧光定量PCR检测方法,并检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平,试验根据GenBank上鸭IL-1β基因序列设计特异性引物,以鸭IL-1β基因克隆质粒为模板,SYBR GreenⅠ为荧光染料,建立鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因的转录水平。结果表明:建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的熔解曲线为特异性单峰,标准曲线方程为y=-3. 329x+39. 731,扩增效率为99. 7%,相关系数为1,批内重复变异系数小于1. 00%,批间重复变异系数小于2. 00%;实时荧光定量PCR方法的检测敏感性是普通PCR方法检测敏感性的1 000倍;以该方法进行检测发现,鸭的法氏囊、肺脏、肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、十二指肠、心脏和胸腺中IL-1β基因mRNA含量分别为428. 45,973. 43,1 394. 19,568. 22,551. 54,839. 91,2 586. 22,1 161. 92,459. 17,3 276. 16 copies/μL,其中胸腺中含量最高,而法氏囊中含量最低。说明试验建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法具有重复性好和敏感性高等特点,可用于鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平的检测分析。 相似文献
8.
细胞因子IL-17作为牛结核病诊断标志物的研究及实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在评价细胞因子IL-6和IL-17mRNA转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验临床筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,采集试验动物抗凝全血,分离、收集外周血淋巴细胞,分别用牛结核菌素(PPD-B)、禽结核菌素(PPD-A)、重组蛋白CFP-10-ESAT-6(CE)、pET-32a载体标签蛋白(PET)或PBS 37℃培养6h,用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的mRNA相对转录水平。结果显示,PET和空白对照PBS类似,不能刺激细胞因子mRNA转录水平的提高,表明CE中包含的PET对试验的影响可忽略不计;牛外周血淋巴细胞经PPD-B、PPD-A或CE刺激后,结核病阳性牛样品中IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平均显著高于结核病阴性牛(P0.05),其中PPD-B刺激效果强于CE和PPD-A,而CE刺激的特异性更好;选取CE作为最佳刺激源,结果显示,IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平之间相关性良好(spearman r=0.79),并初步建立了基于IL-17和IFN-γ转录水平的实时荧光定量PCR检测方法;以此方法对14头结核病阳性牛进行临床检验,IL-17实时荧光定量PCR法的阳性样本检出率为85.7%,高于IFN-γ(71.4%)。本研究结果初步表明,牛分枝杆菌特异性抗原(PPD-B、CE)诱导的IL-17mRNA转录水平与牛结核病相关,以CE为刺激源建立的IL-17实时荧光定量PCR检测方法具有用于牛结核病诊断的潜力。 相似文献
9.
根据GenBank中牛Th1/Th2(BoTNF-α、BoIFN-γ、BoIL-2、BoIL-4、BoIL-6、BoIL-8、BoIL-10)型细胞因子的基因序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立实时荧光定量PCR检测方法。将Th1/Th2型细胞因子基因克隆至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。对建立的Th1/Th2型细胞因子SYBR-GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法进行分析,结果表明牛IFN-α、IFN-β、IFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL范围分别呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。溶解曲线分析表明产物为特异的单峰,具有较高的灵敏性和特异性,重复性较好。建立了检测Th1/Th2型细胞因子的实时荧光定量RT-PCR方法,为在mR-NA水平对牛Th1/Th2型细胞因子的定量分析奠定了基础。 相似文献
10.
《中国动物传染病学报》2015,(3)
根据鸭Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)的基因序列保守区设计特异性引物,以鸭β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立了一种检测鸭TLR3 mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法。该方法的标准曲线在1×102~1×108copies/μL范围内,具有良好的线性关系,相关系数和扩增效率均在0.9以上。熔解曲线显示,PCR产物为单峰,具有高度扩增特异性。重复性结果表明,该方法组内、组间变异系数均小于3%,最低检测浓度达100 copies/μL。利用该方法检测了TLR3在鸭组织器官中的表达和分布情况,结果表明,TLR3在鸭子的各种组织或器官中均有分布,其中以气管的表达水平最高,而在脾脏的表达水平最低。该检测方法的成功建立为研究TLR3在鸭天然免疫过程中的生物学功能提供了良好的技术手段。 相似文献
11.
根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV) NS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103～2.74×10 7拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系.扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52％～1.48％,组间变异系数0.71％～2.21％.检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h. 相似文献
12.
旨在建立一种快速、灵敏、可以同时鉴定食品中多种动物源性成分的方法。根据线粒体环氧酶3(cox3)、细胞色素b(cytb)和线粒体d-loop,分别设计鸭、牛和猪特异性引物序列。应用SYBR实时荧光PCR技术,分析熔解曲线,根据出峰位置的不同,定性识别鸭、牛、猪源成分。单重PCR试验测得鸭、牛和猪PCR扩增产物熔解曲线峰值对应的熔解温度分别为(83.5±0.5)℃、(79.5±0.5)℃和(76.5±0.5)℃。三重PCR体系扩增产物的吸收峰与单重PCR体系扩增产物的吸收峰对应的熔解温度吻合,说明试验的可行性。此外,试验检测鸭成分的灵敏度为0.1%,牛成分的为0.1%,猪成分的为1%。结果表明,该方法成本较低、灵敏度较高,可用于同时定性检测食品中鸭、牛和猪3种动物源性成分。 相似文献
13.
在成功筛选出防治鸭传染性浆膜炎效果较好的中药组方P基础上,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测21日龄雏鸭外周血淋巴细胞（PBMC）IFN-γ和IL-6 mRNA的表达水平,研究该组方对鸭只免疫器官的影响。结果表明,P1组（预防组）鸭脾脏指数和胸腺指数显著或极显著高于y组（阳性对照组）与K组（健康对照组）（P〈0.05;P〈0.01）,P2组（治疗组）鸭脾脏指数和胸腺指数极显著高于K组（P〈0.01）;P1组极显著提高鸭外周血淋巴细胞IFN-γ mRNA的表达量（P〈0.01）;P2组显著提高IFN-γ mRNA的表达量（P〈0.05）;P1组、P2组IL-6 mRNA的表达量有升高的趋势（P〈0.1）。说明组方P能促进机体免疫器官的发育和分泌IFN-γ及IL-6,提高机体抗病力和免疫调节能力。 相似文献
14.
HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。 相似文献
15.
新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较.结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰.对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号.对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍.组内和组间变异系数均小于2％,重复性好.该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法. 相似文献
16.
为了建立鸭先天免疫受体核苷酸寡域1(NOD1)的荧光定量RT-PCR检测方法,依据GenBank中鸡NOD1序列设计特异性引物,克隆获得鸭NOD1序列,设计鸭NOD1、凋亡相关碱性蛋白(ARBP)荧光定量RT-PCR特异性引物,以鸭脾脏mRNA反转录后的cDNA为模板,通过构建质粒阳性标准品,建立检测鸭先天免疫受体NOD1转录水平的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,建立的荧光定量RT-PCR方法对NOD1 mRNA的最低检测量为102拷贝,在1012~102拷贝范围内线性关系很好,R2≥0.999。该方法具有良好的特异性和重复性。应用于感染鸭疫里默氏杆菌Yb2株樱桃谷鸭脾脏中NOD1转录水平的检测,表明该方法可用于临床检测且适用性良好。 相似文献
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鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL~(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL~(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。 相似文献
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设计1对引物,建立RT-PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定120日龄雏鸡不同肠段组织β1基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致(扩增曲线斜率差<0.1),满足使用比较Ct值法对β1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。 相似文献
20.
为建立鸽白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）基因实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上公布的鸽IL-8基因序列,在保守区域设计1对特异性引物,以鸽子淋巴细胞提取的核酸为模板扩增鸽IL-8基因部分片段并克隆到pMD18-T载体上。提取重组质粒通过系列制备标准品,建立鸽IL-8基因SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,实时荧光定量PCR熔解曲线呈单一熔解峰,试验线性相关系数为1.0,IL-8基因的扩增效率为103%。敏感性结果显示最低可检测到16个拷贝数;用该方法检测其他鸽白细胞介素细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）和双蒸水的结果均为阴性。批间、批内变异系数均≤1.52%。因此,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸽IL-8 mRNA的检测,为病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。 相似文献