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以新城疫病毒(NDV)LaSota株为免疫原研制了3株针对NDVHN蛋白的单抗,分别命名为1E5、C3-B7和E6-F11。3株单抗与NDV不同毒株在血凝抑制试验(HI)、ELISA和病毒中和试验中的反应性不同,而同一株单抗与同一个NDV毒株在HI、ELISA以及病毒中和试验中的反应性一致。其中,单抗1E5与NDV标准株(LaSota、F48E8)、8个NDV分离株反应阳性,而与9个NDV分离株反应阴性;单抗C3-B7、E6-F11与所有NDV毒株反应均为阳性。结果表明,3株单抗均是针对HN蛋白上的中和位点,国内部分NDV流行株的HN抗原至少有1个抗原位点发生了变异。 相似文献
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新城疫病毒融合蛋白单克隆抗体的研制 总被引：5，自引：0，他引：5
以纯化的新城疫病毒(NDV)R8E9免疫BALB／C小鼠，最后1次免疫后3d取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2／0)融合。以纯化的NDV和表达NDV融合蛋白(F)的重组鸡痘病毒(rFPV)分别建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光(IIF)方法，并用于单抗筛选的第一、二检测系统。经反复筛选并3次亚克隆后共获得7株针对F蛋白的单克隆抗体，它们的生物学特性和在不同反应系统中的敏感性各有不同。用这7株单抗对国内外不同时期分离的：NDV毒株进行排谱发现，单抗几乎可以与所有毒株反应，表明所得的单抗都是针对NDVF蛋白的抗原保守区。 相似文献
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为分析不同禽源NDV毒株间囊膜蛋白抗原性的差异,作者以超滤纯化的鸡源NDV强毒WF00C株全病毒为免疫原制备NDV特异性单抗,并在其一般生物学特性研究和差异性比较的基础上,通过对其抗体可变区同源性比较及其基因家族中的归属性分析,进一步分析各株单抗的异同性;通过差异性作用位点区域氨基酸序列的分析与融合表达短肽反应性的验证,确定其差异表位关键性氨基酸位点.本研究中共鉴定筛选出了6株单抗:1B6、484、4E6、4E11、5H4和5H9,除484和5H4外,其余均具有血凝抑制(HI)活性和对WF00C株NDV的中和活性,但能够识别线性表位的1B6和4E11却对2株鸽源NDV无HI活性;单抗的异同性分析显示,IB6与4E11、484与5H4的抗体轻重链可变区基因家族来源均相同,186与4E11轻重链互补决定区氨基酸分别仅5个和1个氨基酸不同,而484与5H4则完全相同,4E6和5H9的基因来源和互补决定区氨基酸序列均差异较大;在NDV HN 14线性中和表位上的aa347位有6种氨基酸变化,鸽源毒株在此位点主要为甘氨酸(26/27),而aa349位有3种变化,其中谷氨酸是鸽源毒株的特有指征;IB6和4E11所识别的差异性氨基酸E347和D349同为该表位关键性氨基酸.本研究所获得的3组生物学特性不同的6株抗NDV单抗,可归属为不同质的4种单抗;NDV HN aa349为E是鸽源毒株的特有指征,同时该位点也是线性中和表位上又一新的关键性氨基酸位点. 相似文献
5.
以抗H5亚型禽流感病毒（AIV）JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验（HI）对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素（HA）蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为：2D2、2C8、3D3和3D11。该4株单抗的小鼠腹水的HI效价在2^13～2^15,ELISA效价为1.2×10^5～5.1×10^5。亚类鉴定结果表明,2D2和3D11属于IgG1,2C8属于IgG3,3D3属于IgG2a亚类;特异性试验结果表明,上述4株单抗仅与H5 AIV毒株发生特异性反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、IBV和EDSV-76等病毒反应;鸡胚中和试验结果显示,4株单抗均具有较好的中和活性。本研究成功获得4株针对H5 AIVHA蛋白的特异性单抗,为临床H5 AIV的血清学监测及鉴定提供了必需的试剂。 相似文献
6.
从规模化养殖场鸭群气管和泄殖腔试子分离到新城疫病毒(NDV)27株,用2株针对NDV HN单抗进行抗原表位分析,并选择4个分离株进行F基因高变区(374bp)和HN基因全长序列分析。抗原表位分析结果显示,27个鸭分离株均能与其中一株单抗C3-B7反应,而与另外一株单抗1E5反应为阴性。F基因(374bp)序列分析结果显示,4个鸭分离株均属于NDV ClassⅠ分支,分离株之间核苷酸同源性为99.2%～100%;分离株与NDV ClassⅡ毒株遗传距离为0.9%～9.9%,与NDV ClassⅠ毒株遗传距离为38.5%～41.7%。根据核苷酸序列推导的氨基酸序列表明,4个鸭NDV分离株F蛋白裂解位点氨基酸模式为:112-EROERL-117。HN基因序列分析结果显示,4个鸭NDV分离株HN基因全长1851bp,编码585个氨基酸;同源性比较发现4个鸭NDV分离株之间核苷酸同源性为99.7%～99.8%,与NDV ClassⅡ毒株核苷酸同源性为68.4%～70.5%,与NDV ClassⅠ毒株核苷酸同源性为95.8%～98.0%。本研究结果显示,鸭分离毒均属于NDV ClassⅠ弱毒,在抗原表位和基因序列上与广泛应用的NDV弱毒疫苗株(LaSota)不同,这些毒株的来源有待进一步深入研究。 相似文献
7.
根据1株 ND 单抗与 NDV 分离物在 IIF 试验中的反应性,将8株 NDV 分离物划分为 a、b、c、d、e、f6个不同反应谱组,此反应谱与对照株(F_(48)E_8、NM、I 系、I 系和 La Sota株,)和11株 ND 单抗之反应谱各不相同。HI 试验表明,8株 NDV 分离物的 HA 活性都能被鸡新城疫阳性血清所抑制:大部分 NDV 分离物的 HA 活性能被ND 单抗 F_(2(?)-5-8-4)、L_(2-3-1)、Lc_(24-11)、L_(15-(5))、LE_(22-3)和 M_(10)所抑制;部分 NDV 分离物的 HA 活性能被 ND 单抗LD_(2-3-(7))和 L_(10-4)所抑制;8株 NDV 分离物的 HA 活性均不能被 ND 单抗 FHY_(33-29-3)所抑制。以上结果表明,8株 NDV 分离物之间以及与 NDV 对照株间存在抗原性差异。 相似文献
8.
为鉴定禽传染性支气管炎病毒(IBV)刺突(S1)蛋白的中和抗原表位，本研究通过IBV全病毒免疫BALB/c小鼠，经融合、亚克隆筛选获得了4株稳定分泌抗IBV S1蛋白抗体的杂交瘤细胞株4A11、1B11、5E5和7C9。经鉴定制备的单克隆抗体腹水抗体ELISA效价为106以上，Western blot和间接免疫荧光试验分析显示该单克隆抗体反应性和特异性良好。随后用8种基于S1分型的IBV毒株为试验毒株，同实验室已有的8株IBV S1单抗(1E9、1H1、1E4、3C6、3C7、2F3、2E5、4F9)共12株单抗进行气管环中和活性检测，发现S1蛋白单抗与8种S1亚型的毒株均有不同程度的中和作用。随后，在抗原表位和Western blot分析的基础上，鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域，获得了6个中和抗原表位，其中除416IQTRTEP422表位，其他5个表位仍未有相关报道。本研究成功制备出4株特异性识别S1蛋白且具有中和活性的单克隆抗体，不仅丰富了IBV的单克隆抗体库，为今后研究IBV S1蛋白分子结构提供了关键生物材料... 相似文献
9.
H9亚型禽流感病毒SD96株HA蛋白特异性单抗的制备及鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A／Chicken／Shandong／6／1996（CK／SD／6／96）免疫6周龄BALB／c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0融合。采用血凝抑制（HI）和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚型HA特异性单抗的细胞株1F4C4、9F12D1、2C5H12。3株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对CK／SD／6／96的HI效价分别为2^6、2^4、2^1和2^12、2^10、2^7。特异性试验表明该3株单抗均不与其他主要禽类病毒和其他14个HA亚型的禽流感病毒发生交叉反应。1F4C4和2C5H12抗体亚类为IgG2b,9F12D1为IgG2a。这3株单抗对H9亚型不同抗原群流感毒株有不同程度的中和作用,表现出单抗识别抗原住点的差异性,为进一步研究H9亚型流感病毒的抗原性差异以及抗原识别提供了物质基础和条件。 相似文献
10.
以H4亚型AIV分离株A/鸭/扬州/185/2003免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经血凝抑制(HI)试验筛选并克隆后,获得能够稳定分泌抗体的单克隆细胞株:2C11、6E7、4C8和5C5。4株单抗腹水的HI效价在2~(12)～2~(15),单抗亚类均为IgG2a。4株单抗均能与感染了H4亚型AIV的MDCK细胞发生间接免疫荧光(IFA)反应。并且,均不与其他亚型AIV、NDV、IBV和EDS-76病毒发生HI反应。另外,4株单抗均能使病毒失去感染细胞的能力,显示出良好的中和特性。单抗HI反应谱表明,2C11、4C8、6E7和5C5分别可以抑制10株H4亚型AIV中9、8、7和7株病毒的血凝反应,且均不能抑制A/鸭/苏州/1/2002毒株的血凝作用。 相似文献
11.
禽流感病毒单克隆抗体的制备及其抗蛋白抗原的分析 总被引：2，自引：0，他引：2
以纯化的H9N2亚型禽流感病毒为抗原,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选,获得了8株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明,8株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水的特异ELISA抗体效价可达1∶3.2×103~1∶5.1×106,其中2株HI效价达212。8株单抗与H5亚型血凝素分型抗原不发生血凝,与减蛋综合征(EDS-76)病毒、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)均不反应。亚类鉴定证实,除1C7单抗为IgG2b外,其他7株均为IgG1亚类。Westernblotting试验分析初步表明,8株单抗至少针对纯化病毒粒子3种不同的蛋白抗原,其中3株针对核蛋白(NP),2株针对基质蛋白M1,2株针对血凝素HA/HA1。对感染细胞的Western blotting分析结果与纯化病毒结果基本一致,其中1株未明显沉淀纯化病毒粒子蛋白的单抗可以与感染细胞的M2蛋白多肽反应。 相似文献
12.
用单抗介导的交叉ELISA对IBV毒株的分型研究 总被引：5，自引：1，他引：4
用针对IBV 3种结构蛋白的一组单抗（C1、C2、C3、J1、J2、J3）和6个不同血清型的IBV标准株（Gray株、Connectic株、Holte株、T株、M41株、Arkavas株）进行交叉ELISA试验，显示了6种不同的反应模式；与同一Mass血清型内M41、H52、H120 3毒株进行交叉ELISA反应显示出相同的反应模式；通过地方分离株和标准株与6株单抗的ELISA反应模式比较可将来自河南、山东、江苏、广东、广西、西川等省22个地方株划分为7个不同的抗原群，其中M41抗原群占10株，其仍是我国当前主要的流行型。根据两株中和单抗C2、J1与22个地方株ELISA反应结果，可将地方株分为三大类群，即与J1反应的M41类群，与C2反应的Y类群和J1、C2均不反应的第三类群，C2和J1两株中和单抗可与85％以上毒株发生反应，可为IBV制苗毒株的选择（M41和Y）提供参考依据，此种分型方法较传统的分型方法简便、快速。 相似文献
13.
用新城疫弱毒疫苗株La Sota阳性血清测定NDVMM,NDVLD,NDV-NH3株新城疫病毒地方分离株和标准株La Sota,F48E9的HI效价,以La Sota阳性血清对La Sota疫苗株的HI效价为参照,分析NDV地方分离株与疫苗株抗原交叉性。结果表明,NDV-MM,NDV-LD 2个野毒株HI效价与NDV-LD HI效价相近,但比La Sota HI效价低2．3个～2．7个滴度;NDV-NH与F48E9 HI效价相近,比La SotaHI效价低4．2个～4．3个滴度,提示以上3个野毒株与疫苗株之间的抗原相关性差异较大。动物免疫保护试验结果表明,经La Sota免疫（HI效价〉2^5）后攻毒保护率为80％-100％。 相似文献
14.
分别对鸡源、鸭源、鹅源新城疫病毒(NDV)强毒分离株(WF00C、WF00D、WF00G)的F基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行分析.结果表明,各分离株F基因均含1个完整的开放阅读框(ORF),全长为1662 bp,编码553个氨基酸,有6个潜在的糖基化位点,裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒株特征相符,具有第101位的K(赖氨酸)和121位的V(缬氨酸),符合基因VK型NDV特征;WF00C株有13个半胱氨酸(Cys)残基,WF00D株和WF00G株各有12个Cys残基;在限制性内切酶(RE)位点(nt334～1682)的分布上,3个毒株均存在多数鹅源分离株特有的973 nt和1249 nt Rsa Ⅰ位点;WF00D株与WF00C株、WF00G株以及GenBank的15株各基因型代表株的F基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源性为84.7 %～99.3%,推导的氨基酸序列同源性为88.4%～98.9%;3个分离株间的同源性较高,其与ZJ1、SF02和NA_1等鹅源毒株之间差异较小,而与LaSota、F48E9等毒株之间差异明显.根据NDV系统发育进化树、酶切位点分析以及基因分型结果,证明它们的基因型均为Ⅶd亚型. 相似文献
15.
为了检测引发昆明地区某鸡场鸡群疑似新城疫(ND)的毒株基因型,试验将采集到的疑似ND病料接种至9日龄鸡胚尿囊腔,对鸡胚尿囊液进行血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验和RT-PCR鉴定,对RT-PCR扩增产物进行克隆、测序,然后分析HN基因编码区序列同源性及绘制遗传进化树。结果表明:HA试验凝集价为1∶2~8,HI试验凝集价为1∶2~5,禽流感病毒(AIV)的HI试验均为阴性,初步鉴定分离株为新城疫病毒(NDV),将其命名为KM-16;RT-PCR扩增出的目的条带大小为1 759 bp;KM-16分离株与China-Guangxi14-2002和Japan-SG106-1999的HN基因的同源性为98.6%和98.7%,与经典毒株F48E9和La Sota C5的HN基因的同源性为84.7%和81.9%,与其他参考毒株的HN基因的同源性在95.2%～96.4%之间;KM-16毒株与China-Guangxi14-2002和Japan-SG106-1999等基因Ⅶ型毒株处于同一进化分支上。说明KM-16分离株为基因Ⅶ型NDV毒株。 相似文献
16.
用低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株全病毒作为抗原,制备能够用于建立ELISA检测AIV的特异性单抗;以间接ELISA和HI试验筛选出阳性克隆,并经有限稀释法三次亚克隆之后,共获得三株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在Dot-ELISA试验中三株单抗中的两株与13个AIV H9N2国内分离株、4个AIV H5N1国内分离株都反应,而与10个NDV国内分离株,IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应.一株与13个AIV H9N2国内分离株反应,与4个AIV H5N1分离株、NDV、IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应. 相似文献
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《中国动物传染病学报》2016,(5)
对2013年从健康野生鹭科候鸟中分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)蚀斑纯化后,选择5株病毒进行了生物学鉴定和遗传进化分析。致病指数和脑内接种指数测定结果显示5个分离株均为弱毒株;F蛋白裂解位点处氨基酸序列均为112ERQERL117,具有典型的弱毒株特征。交叉HI试验结果发现ClassⅠ分离株与La Sota的HI抗原同源性为0.56~0.57,与ClassⅡ强毒株的HI抗原同源性为0.44~0.51;遗传进化分析发现5个NDV毒株与目前流行的强毒株遗传关系较远,均属于ClassⅠ3c亚型,表明健康鹭携带I类新城疫病毒,在迁飞的过程可能传播给家养水禽,对其构成潜在威胁,提示加强野鸟NDV的监控及流行病学研究具有紧迫性和重要性。 相似文献
18.
以H3亚型禽流感病毒(AIV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化。结果获得了4株针对H3亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,分别命名为1D7、1F9、5A4、5F5。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为212～214。用H1、H6、H10亚型禽流感病毒各2株,H4、H5、H9和新城疫病毒(NDV)各1株进行特异性试验。结果表明:所有这些单抗仅与H3亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV及NDV反应。用28株H3亚型禽流感病毒进行排谱试验,结果证明:4株单抗均具有广谱性,其中1F9、5A4、5F5与受试的28株H3亚型AIV均反应,而1D7只与其中的26株反应。以上单抗将为控制畜禽及人类的流感提供必需的诊断试剂。 相似文献
19.
《中国兽医学报》2019,(12):2282-2287
为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗免疫抗体与病毒感染抗体鉴别诊断方法,分别以PRV变异毒株的gE或gB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选所需单克隆抗体,获得6株抗PRV gE蛋白的单抗(3E6、7E1、7C5、10C3、15C1、14C1)和6株抗PRV gB蛋白的单抗(1C1、5D2、2F11、5G8、10C7、8H5)。IPMA检测结果显示,gE蛋白单抗能识别PRV变异毒株,但不识别疫苗株;而gB蛋白单抗可同时识别PRV变异毒株和疫苗株。gE单抗10C3和gB单抗10C7的ELISA效价和IPMA效价均分别达1∶5×10~(5.0)和1∶8×10~(3.0)以上。所筛选出的单抗均不与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)等其他常见病毒发生交叉反应。gE蛋白和gB蛋白的表达及单抗的制备为PRV感染抗体与疫苗免疫抗体鉴别诊断(DIVA)试纸的研发奠定基础。 相似文献
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影响鸡IBV血凝因素及HI试验抗原制备的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
选择没有自然血凝性的三个标准IBV毒株(M41、Gray、T株)和四个由西北农大禽病研究室分离的陕西省地方株[X、Fu、W和H株(有自然血凝性)]，在非免疫鸡胚上增殖后，用蔗糖透析法浓缩10倍，再分别采用三种方法处理，制备IBV-HA抗原：1)用浓缩4倍的兔A型魏氏梭菌培养液滤液(R．W．F．C4)处理IBV；2)用2．5U／mlI型磷酸酯酶C(PLC1)处理IBV；3)用1％胰酶处理IBV。结果显示，除T株仍不具有血凝性外，其余毒株都有了较高的血凝价。IBVM41株、X株HA效价株高达2^8，Fu、Gray、W、H株的HA效价也达2^7—2^9。但是，用方法3)来制备HA抗原没有任何实用价值。因为1％胰酶本身具有非常强的非特异性凝集作用，非特异性HA价高达8log2。而采用R．W.F．C4和2．5U／ml PLC1处理IBV浓缩毒制得的IBV—HA抗原，除T株外，均能凝集鸡红细胞，且该凝集作用可被特异的IBV抗血清所抑制，而不能被ND、EDS—76、IBD等其它鸡病阳性血清所抑制，说明该抗原具有较强的特异性。本试验还对影响IBV血凝试验和血凝抑制试验的各种因素进行了研究。比较了用R．W．F．C4和用2．5U／ml PLC1处理IBV制备HA抗原血凝价，结果显示二者的血凝价是一致的，所以完全可以用廉价的兔A型魏氏梭菌培养液代替昂贵的PLC1作为抗原处理液。本试验还采用IBV—M41株和陕西省地方肾型株X株制备IBV—HA双价抗原，结果表明，用上述IBV—HA二价抗原所测出的各毒株抗血清的HA效价和用各毒株所制得的IBV—HA单价抗原所测出的相应毒株抗血清的HI效价差异不显著，说明IBV二价HA抗原的抗原交叉性广泛，可用于IB的免疫监测和诊断。本试验还将在同一条件下获得的免疫鸡血清分别采用HI和CEKC—SN二种方法所测得的抗体效价进行了比较，结果经统计学分析表明：HI效价与CEKC—SN效价呈正相关，相关系数为0．6585，且HI法比ECKC—SN法省时、省力。 相似文献