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[目的]本文旨在探究热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响,并对miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p进行生物信息学分析与靶基因预测,揭示热应激下miRNA影响骨骼肌发育的调控机制。[方法]通过RT-qPCR技术研究热应激对羊成肌细胞miRNA表达量的影响;利用miRBase数据库获取不同物种中miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的前体序列和成熟序列,并利用MEGA X软件构建系统进化树进行相似性分析;通过TargetScan、miRDB、RNA22、miRWalk对上述miRNA进行靶基因预测,使用DAVID对预测出的共同靶基因进行GO功能与KEGG通路富集分析,最后进行miRNA、共同靶基因与KEGG通路的关联分析。[结果]热应激显著下调羊成肌细胞在增殖阶段与分化阶段miRNA的表达。miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在不同物种间的保守性较高,除了牛的miR-24以外,成熟序列基本相同,种子序列完全一致。预测出的共同靶基因主要富集在细胞增殖、分化、周期、凋亡、迁移等GO条目,以及mTOR... 相似文献
2.
《西南农业学报》2020,(1)
【目的】为阐明同一个miRNA簇基因(miR-665,miR-127-5p,miR-136-3p,miR-136-5p,miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433)在不同组织山羊表达特征和成肌细胞中表达水平。【方法】本研究采用qRT-PCR方法检测miRNA簇基因在山羊组织以及C2C12细胞不同生肌时间点的动态表达模式。【结果】miRNA簇基因(miR-665,miR-127-5p,miR-136-3p,miR-136-5p,miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433)在不同波尔山羊组织中均广泛表达。miR-127-5p,miR-136-3p, miR-432-5p,miR-432-3p和miR-433在山羊肌肉中高表达,miR-136-5p和miR-665在肌肉表达量低。miR-136-3p表达量随肌细胞增殖和分化逐渐升高;miR-127-5p,miR-432-3p,miR-432-5p,miR-433和miR-136-5p表达量呈现先升高后降低的趋势;miR-665在随C2C12细胞增殖和分化表达逐渐降低。【结论】本研究结果为进一步阐明miRNA簇基因调控骨骼肌的生长发育的调控功能奠定了理论基础。 相似文献
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前期研究表明,miR-127-3p参与骨骼肌细胞分化的调控,但对于miR-127-3p调控的靶基因及其在成肌分化中的作用还不清楚。应用qRT-PCR与细胞形态学方法研究过表达miR-127-3p对C2C12成肌细胞分化及成肌标志基因MyoD、MyoG和Myosin表达的影响;RNA-Seq分析过表达miR-127-3p对成肌细胞转录组的影响,鉴定差异表达基因并对其功能进行初步研究。结果表明,过表达miR-127-3p显著促进C2C12细胞的成肌分化与MyoD、MyoG和Myosin表达;RNA-Seq分析共鉴定到3个差异基因,均为下调基因,其中包括2个转录因子(Irf7和Ddit3)。GO与KEGG分析显示,这些差异基因显著富集于免疫和能量代谢过程/信号通路。生物信息学分析发现,miR-127-3p可与Ddit3基因的CDS区发生碱基互补配对,进而抑制其表达。表明在转录组水平上,miR-127-3p可能通过直接靶向Ddit3基因/转录因子调控免疫与能量代谢类基因的表达,进而调节成肌细胞分化。 相似文献
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《新疆农业大学学报》2018,(4)
为了确定宿主miR-142a-3p是否参与猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)感染致神经损伤的过程,本研究利用实时荧光定量PCR方法对不同时间点感染PHEV的N2a细胞和BALB/c小鼠脑组织中miR-142a-3p的表达情况进行了检测。结果显示,在PHEV的体内外感染模型中,miR-142a-3p的表达量均明显上调。进而通过生物信息学软件预测分析,筛选出跨膜蛋白59(Tmem59)可能是miR-142a-3p的靶基因,并利用双荧光素酶报告系统对该靶基因进行验证。结果表明,宿主感染PHEV后,体内的miR-142a-3p表达明显上调,并筛选出与机制相关的靶基因Tmem59。 相似文献
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【目的】全面了解绵羊卵巢组织miRNAs表达情况,分析产单羔和产双羔绵羊卵巢miRNAs表达差异,从而为探讨miRNAs在繁殖力调控中的作用提供依据。【方法】应用多物种miRNA芯片对绵羊卵巢组织miRNA进行表达分析。首先选择经产单羔羊和双羔羊,发情后采集双侧卵巢提取总RNA,分离小片段 RNA与miRNA芯片杂交,然后进行数据分析获得绵羊卵巢组织miRNAs表达谱;利用生物信息学软件,以q-value ≤ 5%,且Fold Change ≥2 或≤0.5的标准筛选单羔羊和双羔羊卵巢差异表达miRNAs,并利用q-PCR技术验证芯片结果;分别采用microT和miRDB两种方法预测差异表达miRNAs的靶基因,然后合并两种方法结果数据取二者的交集,用在线软件对靶基因进行GO功能注释。【结果】在检测的来自所有物种的miRNAs中,有5 448个miRNAs在单羔和双羔羊卵巢组织中共同表达,22个在单羔羊卵巢中特异性表达,15个在双羔羊卵巢中特异性表达;对绵羊中已报道的103个miRNAs,比较其在两组母羊卵巢组织中的表达变化,共获得11个差异表达miRNAs,其中4个上调表达,7个下调表达;随机选择一个上调和一个下调表达的miRNAs进行q-PCR验证,定量结果与芯片结果一致,说明芯片结果准确、可信;预测获得7个miRNAs的靶基因,分别是：oar-miR-370-5p、oar-miR-376b-5p、oar-miR-381-5p、oar-miR-412-5p、oar-miR-541-3p、oar-miR-544-5p和oar-miR-1185-5p,每个miRNA获得的靶基因个数分别为：115、71、1、5、8、135和23个。GO注释结果显示,miR-376b-5p和miR-1185-5p的靶基因主要参与形成细胞内组分和细胞器,在分子功能分类中,绝大部分基因为连接分子类和催化活性分子类,在生物学过程分类中,主要参与细胞增殖、分化、凋亡过程和代谢过程;同时miR-376b-5p的靶基因IGF-1、DAZL、MTOR、MET、NEDD4和miR-376b-5p的靶基因AHR参与生殖过程的调控。【结论】成功构建了绵羊卵巢miRNAs表达谱,获得产单羔母羊和产双羔母羊卵巢组织差异表达miRNAs,这些miRNAs可能与绵羊卵泡发育和产羔数多少有关。 相似文献
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【目的】明确miR-486对绵羊骨骼肌卫星细胞增殖及PI3K-Akt信号通路相关基因表达的影响,为揭示miR-486对绵羊骨骼肌发育的调控机制打下基础。【方法】以巴什拜羊1日龄羔羊后肢骨骼肌卫星细胞为研究对象,通过转染miR-486 mimics和miR-486 inhibitor致使绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调或下调,探究miR-486对骨骼肌卫星细胞增殖速度及PI3K-Akt信号通路中PTEN、GSK3b、PRKCα、Raf-1、MAPK1、PKN1、Casp9和SGK1等8个相关基因表达变化的影响。【结果】空白对照及转染miR-486 mimics、miR-486 mimics negative control和miR-486 inhibitor negative control的绵羊骨骼肌卫星细胞均表现出典型的S形增殖曲线,但各处理间的细胞增殖速度存在明显差异。当绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调可促使细胞进入快速增殖状态,而miR-486水平下调可使细胞保持静止状态。实时荧光定量PCR检测结果表明,当绵羊骨骼肌卫星细胞中miR-486水平上调时,可引起PTEN、Raf-1和MAPK1基因相对表达量极显著下调（P<0.01,下同）,PRKCα和PKN1基因相对表达量极显著上调,SGK1基因相对表达量显著上调（P<0.05）;而GSK3β和Casp9基因相对表达量在不同处理组绵羊骨骼肌卫星细胞间的差异均不显著（P>0.05）,可能在维持绵羊骨骼肌卫星细胞基本生命活动中发挥作用。【结论】miR-486通过调控PI3K-Akt信号通路相关基因的表达而参与绵羊骨骼肌卫星细胞生长发育及增殖,为深入研究miR-486对绵羊骨骼肌发育的调控机理及优质肉羊品种培育打下了理论基础。 相似文献
8.
《中国农业科学》2020,(20)
【目的】探究蛋白酶体β5亚基(proteasome subunit beta type-5, PSMB5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNAsi-RNA-PSMB5 (si-PSMB5),构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5(pcDNA-PSMB5),采用(Lipofectamine)3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链(MyHC)蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期(P0.05)。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著(P0.05)。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05);而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05)。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。 相似文献
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为了检测miR-222-3p在填饲鹅不同组织中的表达情况，并对其靶基因进行预测和验证，探讨miR-222-3p在鹅肥肝形成中的功能。运用实时荧光定量 PCR技术检测miR-222-3p 在填饲鹅肝脏、胸肌和腹脂中的表达量；采用生物信息学方法对鹅miR-222-3p的靶基因进行预测，荧光定量PCR技术检测预测靶基因在肝脏中的表达量，并利用双荧光素酶基因报告系统验证其靶向关系。结果显示：相比对照组，miR-222-3p 在填饲鹅肝脏和腹脂中的表达量均显著升高；生物信息学预测结果显示MARF1和B4GALNT3基因在3’UTR区域存在miR-222-3p的潜在结合位点，且这两个基因在鹅肥肝中均显著下调，而双荧光素酶基因报告系统显示只有MARF1基因与鹅 miR-222-3p存在靶向关系。结果表明，miR-222-3p在鹅肥肝中表达量显著上调，且可能通过其靶基因MARF1对鹅肥肝的形成发挥调控作用。 相似文献
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miRNA作为进化保守的非编码RNA,在细胞的发生、发展和增殖过程发挥重要功能。前期研究鉴定到miR-615是剩余采食量相关的差异miRNA之一,但其潜在靶基因及在牛各组织的表达规律尚不清楚。对miR-615在各物种间的保守性,潜在靶基因及其富集通路进行分析,通过茎环荧光定量PCR技术检测牛各组织中miR-615的表达。结果表明,miR-615成熟序列在各物种间保守性较高,靶基因显著富集于PI3K-ATK、Ras和MAPK等与肌肉发育相关的通路中。qRT-PCR结果显示, miR-615在皮下脂肪中的表达量最高,其次是背最长肌;miR-615在背最长肌和心脏组织中的表达差异不显著,但在皮下脂肪中的表达显著高于背最长肌和心脏组织;在其他组织中miR-615均呈现低表达模式,且各组织间表达差异不显著。研究结果将为进一步探讨miR-615在牛肌肉发育中的作用奠定理论基础,同时也为解析牛肌肉发育的分子机制提供新思路。 相似文献
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【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡,同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗,文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上,获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p,利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况;通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况;构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体,在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系;在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达,使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响;同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织;RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和 BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达,miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期,而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期,表现出负调控的现象;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）,阴性对照组则没有显著影响;过表达miR-221-3p,靶基因BCL2L11 mRNA表达水平显著降低,同时,卵泡颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas的表达量也显著降低（P<0.05）;EdU试验分析显示,过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%,极显著高于阴性对照组的10.43%（P<0.01）。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件,BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡,该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。 相似文献
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鸡miR-133a靶向调控BIRC5基因的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5（BIRC5）进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示BIRC5是miR-133a的靶基因,点突变试验证实了miR-133a在BIRC5上结合的靶位点。【结论】miR-133a是与鸡骨骼肌发育高度相关的miRNA,且鸡BIRC5基因是miR-133a的靶基因。 相似文献
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【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。 相似文献
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北京油鸡和来航鸡脾脏差异表达microRNA的鉴定与分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】明确北京油鸡和来航鸡脾脏重量、组织结构及其miRNA表达谱的差异,筛选与两个鸡种免疫应答能力差异相关的候选基因,为家禽抗病育种研究奠定基础。【方法】选取1日龄同期孵化的北京油鸡和来航鸡母雏各45只作为试验材料,在相同营养水平和环境条件下饲养,42日龄测量体重和脾脏重。每个品种随机选取3只个体（体重接近群体均值）,取其一半脾脏组织制作石蜡切片,利用H.E.染色,显微镜下观察脾脏组织结构、脾小体的数量和动脉周围淋巴鞘厚度。提取另一半脾脏组织中的小RNA,等量混合组成2个RNA池,构建cDNA文库,利用Solexa平台进行高通量测序。测序结果与参考基因组数据库比对获得表达基因。利用Mireap软件预测新miRNAs基因。利用RPKM（reads per kb per million reads）方法计算基因的表达量,根据FDR（false discovery rate）＜0.001和|log2 ratio(T/CK)|≥1的标准筛选差异表达的基因。利用TargetScan和Pictar软件预测差异表达miRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG数据库功能注释。利用DAVID软件对靶基因蛋白进行富集分析。将预测靶基因与已知脾脏重和脾脏指数相关QTL区域注解的基因取交集。【结果】在42日龄,北京油鸡的体重和脾脏重均显著高于来航鸡（P＜0.01）。组织学观察显示,两个鸡种的脾脏组织结构发育完整,可见清晰的白髓、红髓、脾小结和动脉周围淋巴细胞鞘。与来航鸡相比,北京油鸡脾小体的数量更多、动脉周围淋巴鞘更厚,鞘内淋巴细胞也更为密集。高通量测序在两组样本共鉴定出486种已知miRNA 、130个候选miRNA 和216个共表达miRNA 。两组间显著差异表达的miRNA共计35种,其中在北京油鸡中有8个表达上调,27个表达下调,它们的变化倍数在1.002-10.41之间。差异基因表达丰度在前5位的miRNA是miR-2954、miR-6606-5p、miR-146b-5p、miR-21-3p和miR-21-5p,对其2 767个靶基因的生物信息学分析结果显示,它们参与了T和B淋巴细胞的分化、免疫器官的发育、蛋白质磷酸化和细胞形态发生等生物学过程,并在泛素介导的蛋白水解、凋亡和磷脂酰肌醇信号系统等14个通路中显著富集。miR-6606-5p、miR-146b-5p的共同靶基因BLM和miR-2954的靶基因IRF8均定位于脾重或脾指数相关的QTL区域。【结论】（1）42日龄北京油鸡和来航鸡脾重、组织结构及其miRNA表达谱的确存在一些差异。（2）某些重要的差异高丰度表达miRNA(如miR-2954、miR-6606-5p、miR-146b-5p 、miR-21-3p和miR-21-5p ) 可能通过对靶基因调控,来参与调节T、B淋巴细胞分化、增殖、激活等过程,进而影响脾脏的重量、组织结构及其免疫应答能力。 相似文献
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【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明：在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站（StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid）预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因（PCNA, CDK1, CCND2）、抗凋亡基因（Bcl-2）和促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组（P<0.01）;双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高（P<0.01）,结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性（P<0.01）;同时,qPCR及Western Blot表明：过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达（P<0.01）。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力（P<0.01）,通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组（P<0.01）,促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后, G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组（56.81%,P<0.01）,减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降（P<0.05）;最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,降低了促凋亡基因（Bax）的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】 miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。 相似文献
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【目的】 全面了解鸡下丘脑高丰度miR-101的组织表达情况和潜在生物学功能,为揭示下丘脑调控鸡机体能量平衡的分子机制奠定基础。【方法】 采用茎-环定量RT-PCR方法检测miR-101在固始鸡4个发育阶段、13种组织中的表达,利用Pictar算法预测miR-101的靶基因并对预测靶基因分别进行Gene Ontology分析、通路分析和分层富集。【结果】 miR-101的表达具有明显的时序特征和组织特异性,胚胎期各组织中的表达水平明显高于出壳后,脑部各组织中的表达水平明显高于其它被检测的组织,并在14胚龄下丘脑以及17胚龄小肠和腿肌中高丰度富集;miR-101的预测靶基因在生物学调节、代谢过程、发育过程和细胞过程等基本生物学过程中显著富集;针对神经系统发育的生物信息学分析显示,miR-101调控功能主要涉及脑发育、神经元分化、神经发生调节、神经胶质细胞分化和星形胶质细胞分化等生物学过程。【结论】 miR-101为脑部组织高丰度表达miRNA,在脑发育相关的许多生物学过程中可能发挥重要的调节作用。 相似文献
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为筛选miR-133a-5p影响鸡肌肉发育的关键靶基因,本研究利用在线数据库预测miR-133a-5p靶基因,并对靶基因进行富集分析和构建蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络,寻找网络图中有意义的模块。通过单因素方差分析,比较分析肌肉和其他组织中的miR-133a-5p表达量;再依据microRNA与靶基因负相关的作用机制,将miR-133a-5p靶基因与肌肉中相对下调基因取交集,筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明:1)共获得157个靶基因;2)GO富集分析显示,靶基因参与多个生物合成过程的调控和代谢过程;KEGG富集结果包括MAPK信号通路等多种信号通路,也包括肌动蛋白细胞骨架等与肌肉发育直接相关的通路;3)PPI网络图共筛选到4个有意义模块,涉及17个基因;4)miR-133a-5p在肌肉中表达显著上调(相对肺、肝脏和肾脏),与肌肉相对下调基因取交集后,筛选到SOX5(SRY-box 5)、PRTFDC1(Phosphoribosyl transferase domain containing 1)、THRB(Thyroid hormone receptor beta)、THBS2(Thrombospondin 2)和ARRDC3(Arrestin domain containing 3)5个基因;5)在GSE93855的表达谱中,PRTFDC1和THRB在肌肉中表达量最低,而RNA22 v2评估结果显示,仅SOX5和THRB存在P<0.05的结合位点。综上,miR-133a-5p很可能是通过SOX5、PRTFDC1、THRB、THBS2和ARRDC3影响肌肉发育,其中SOX5和THRB尤为重要。本研究为进一步研究鸡miR-133a-5p提供了理论基础和数据支撑。 相似文献